王永明，劉娟，王曉麗，章剛

（山東濱州華宏生物制品有限責任公司，山東濱州 256600）

雞毒支原體感染(MGI)，通常被稱為雞敗血性霉形體感染或雞慢性呼吸道?。–RD），在火雞則成為傳染性竇炎，臨床上以呼吸道癥狀為主，特征表現(xiàn)為咳嗽、流鼻液、呼吸道音，嚴重時呼吸困難和張口呼吸。

該病發(fā)展緩慢且病程長，并常與其他病毒或細菌混合感染，剖檢時可見鼻竇和氣管有卡他性滲出物以及嚴重的氣囊炎，感染此病幼雞發(fā)育遲緩，飼料報酬率低，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降，病原可在雞群中長期存在和蔓延，并可通過蛋傳播給下一代。

本病廣泛分布世界各地，隨著養(yǎng)雞業(yè)集約化程度的提高，飼養(yǎng)方式的改變以及飼養(yǎng)密度的提高，在通風不良、空氣中氨和灰塵增加或氣溫驟降等環(huán)境中，容易發(fā)生本病。其他諸如疫病混合感染，甚至接種雞新城疫和傳染性支氣管炎等活疫苗后也可誘發(fā)本病，目前該病已成為集約化養(yǎng)雞場的重要傳染病，嚴重影響著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。

一、病原學

本病的病原體為雞毒支原體（MG）。其大小為250～500 nm,能通過450 nm的細菌濾器，形態(tài)不一，呈高度多形性，常見的有球狀、絲狀，還有桿狀、環(huán)狀、螺旋狀等不規(guī)則形態(tài)。姬姆薩染色著色良好，革蘭氏染色陰性，著色較淡。MG為需氧或兼性厭氧菌；在人工培養(yǎng)時對營養(yǎng)要求較高，需要在培養(yǎng)基中加入10%～15%的滅活豬或馬血清、胰酶水解物和酵母浸出物才能生長。在固體培養(yǎng)基上，需置潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)3～10 d才能形成表面光澤透明、邊緣整齊、露滴樣的小菌落，且菌落為“煎蛋樣”。MG可吸附雞、火雞和倉鼠等動物的紅細胞，這是與非致病性禽源支原體的主要區(qū)別。

MG能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、不發(fā)酵乳糖、衛(wèi)茅醇或水楊甙、不水解精氨酸、可還原四氮唑（變紅）和四唑藍（變藍），對毛地黃皂甙敏感。

MG對理化因素的抵抗力不強，對紫外線敏感，陽光直射便迅速喪失活力，一般常用的化學消毒劑均能迅速將其殺死；50℃約20 min即可將其滅活，在沸水中立刻死亡。液體培養(yǎng)物在4℃保存不超過1個月，在-30℃中可保存1～2年。MG對鏈霉素、四環(huán)素族、氯霉素、紅霉素、泰樂菌素敏感，但也易產(chǎn)生耐藥性。

二、雞毒支原體的發(fā)病機理及免疫機制

（一）雞毒支原體的致病力MG的致病力包括病原性和毒力兩方面。其毒力的強弱因分離株的來源、傳代方式、傳代次數(shù)的不同而有差異。例如：MG弱毒株F株在液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代36代后其對雞的致病性減弱，有的菌株經(jīng)75次、95次肉湯培養(yǎng)基傳代后失去感染力。

MG的致病力與其本身的神經(jīng)氨酸酶、過氧化氫或者其他溶血素、血卵磷脂酶、內(nèi)毒素有關。這些酶或毒素引起細胞損傷或死亡，或使宿主細胞抗原性改變，近年來發(fā)現(xiàn)支原體的感染可引起自身免疫性反應。感染發(fā)生時，MG首先吸附到宿主細胞的表面，在禽的呼吸道內(nèi)，氣管上皮細胞通過膜上的唾液酸受體與MG結(jié)合，從而使纖毛運動受阻，細胞變性，最后脫落。被感染的細胞線粒體腫脹，細胞漿呈網(wǎng)狀。并且，MG亦可在細胞的表面進行存活繁殖，鑒于MG的這一特性，有些學者建議將細菌、病毒等編碼保護性抗原的基因克隆入弱毒支原體，用這種重組支原體做免疫接種，能夠提高禽類對不同疾病的抵抗力，同時還可以降低免疫的次數(shù)，減少禽類對免疫的應激反應，而且不會影響免疫接種的效力。

從MG的表面結(jié)構(gòu)看，細胞膜上有特殊的末端結(jié)構(gòu)和黏附蛋白因子，MG可以借助細胞膜上特殊的末端結(jié)構(gòu)牢固地吸附于宿主細胞表面，同時將其微管插入細胞內(nèi)，將核酸、酶等物質(zhì)注入宿主細胞，并將酶所分解的產(chǎn)物，如核苷酸及宿主細胞膜的脂肪酸、甾醇等吸入細胞內(nèi)，以供菌體利用，從而影響宿主的糖代謝及分子合成。雞毒支原體產(chǎn)生的毒素為神經(jīng)毒素，能與細胞緊密結(jié)合；產(chǎn)生的過氧化氫有溶血能力，可在馬鮮血瓊脂上引起溶血。

（二）雞毒支原體的發(fā)病機理雞毒支原體一旦進入雞體后，首先通過其表面的黏附蛋白吸附于上呼吸道黏膜相應的受體上，進而生長繁殖，引起上呼吸道特別是鼻道的炎癥，由于黏膜的充血和漿液滲出，遂出現(xiàn)流鼻涕和打噴嚏癥狀；繼而因鼻黏膜腺體分泌增強，鼻道充斥大量粘液。隨著炎癥的蔓延，受損的部位擴大至鼻鄰近組織和眶下竇、氣管、支氣管、肺和氣嚢等處。因氣管內(nèi)積存多量炎性滲出物，乃出現(xiàn)呼吸音。呼吸道內(nèi)大量炎性滲出物的蓄積使空氣進出受阻和呼吸容量減少而出現(xiàn)明顯的呼吸困難，表明了呼吸道組織受損以及由此所產(chǎn)生的病變是本病發(fā)病學的主導環(huán)節(jié)。雞的敗血支原體感染按其性質(zhì)是一種經(jīng)過緩慢的傳染病，當飼養(yǎng)管理條件良好時，疾病的發(fā)展很慢，有的幾乎不顯癥狀，而當飼養(yǎng)條件惡劣或伴有其它感染時，則病情顯露和加劇。特別是混合感染時，出現(xiàn)的癥狀、病變比單純敗血支原體感染要復雜的多，其發(fā)病機理也不盡相同。本病最常見的混合感染是大腸桿菌、巴氏桿菌、雞嗜血桿菌以及傳染性支氣管炎病毒等。例如當并發(fā)大腸桿菌感染時，?？吹嚼w維素性心包炎、肝周炎、氣嚢炎和腹膜炎；并發(fā)巴氏桿菌感染時，可見肝臟小灶狀壞死，皮下、十二指腸、心外膜和心冠脂肪出血等變化。

另外，雞毒支原體感染后，雞雖然可以產(chǎn)生一定的免疫力，但雞毒支原體在體內(nèi)持續(xù)存在，主要是MG通過其編碼抗原基因的相可變表達（開/關轉(zhuǎn)換）和高突變，使其抗原特別是粘附素的高度變異，使它可以逃避宿主的免疫反應，而在宿主體內(nèi)長期持續(xù)存在。

（三）雞毒支原體的免疫機制MG感染雞后，一般病雞體內(nèi)最先出現(xiàn)的是IgM，而后是IgG。有時在不同的菌株，也出現(xiàn)一些細小的差別，在R株感染實驗中，病雞會特異的出現(xiàn)IgM的兩個峰值；而在F株感染試驗中，則無此現(xiàn)象，抗體呈規(guī)律性出現(xiàn)。法氏囊在MG感染產(chǎn)生抗體的過程中具有重要作用，盡管抗體凝集滴度與氣囊的攻毒保護率并不呈正相關，但確實會在野毒感染時減輕氣囊的發(fā)病程度，說明抗體對抵抗MG的感染具有部分的保護作用。試驗證明，給雞注射大劑量MG抗體也不能抵抗MG強毒對氣囊的攻擊，帶有母源抗體的雛雞對MG強毒仍然易感，因此許多人認為雞毒支原體病的免疫機理是以T細胞介導的細胞免疫為主。鑒于MG的感染首先是對呼吸道黏膜的一個吸附過程，所以，人們對于MG黏膜免疫的研究也發(fā)展起來，以期能為MG的防治提供依據(jù)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，無論是強毒、弱毒，包括滅活苗，均能誘發(fā)禽體產(chǎn)生IgA。高水平的卵黃抗體，可以阻斷MG的垂直傳播從而為雛雞提供一定的保護力。

三、診斷

MG感染后，大多成年雞表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，蛋的品質(zhì)下降，但往往很少顯現(xiàn)臨床癥狀，呈隱形攜帶，只有當它與其它病原協(xié)同感染時，才出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，這就為其臨床診斷帶來了困難。所以，在CRD的診斷中，往往要通過必要的實驗室診斷達到確診的目的。

血清學方法是臨床診斷MG感染應用最普遍的方法，血清學試驗呈陽性者，結(jié)合臨床癥狀就可以在MG分離和鑒定之前作出初步診斷。用于檢測MG的血清學試驗很多，但都不同程度的缺乏特異性和敏感性。分子生物學方法也常用于MG的感染。

（一）MG病原的分離鑒定MG的分離鑒定是診斷本病最可靠的方法，也是最經(jīng)典的方法，通常用人工培養(yǎng)基、雞胚、組織培養(yǎng)物(雞腎細胞培養(yǎng)物和雞氣管培養(yǎng)物)分離病原體。此法工作量大，耗費時間長，不適合于生產(chǎn)上的快速診斷和監(jiān)測，從而限制了其在畜禽臨床診斷中的推廣應用。

（二）血清學診斷方法生產(chǎn)上常用血清學方法來診斷MG感染。常用的血清學方法有血清平板凝集試驗(SPA)、血凝抑制試驗（HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)和斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot—ELISA)等。

1.平板凝集試驗(SPA)。它是應用最廣泛的檢測方法之一，具有結(jié)果清楚、易觀察、操作簡單、快速敏感、重復性好等優(yōu)點，是一種快速簡便的診斷方法，雖然該方法會出現(xiàn)一些非特異性凝集反應，特別是當前養(yǎng)禽業(yè)滅活苗的大量使用，使假陽性的比率有所提高，但SPA用來檢測IgM抗體是非常有效的。IgM是機體受到感染后，發(fā)生免疫反應最早產(chǎn)生的免疫球蛋白，這就為早期診斷提供了方便，該方法得到廣泛的應用。

2.血凝抑制試驗(HI)。主要檢測血清中的IgG，HI具有特異準確的優(yōu)點，可以進一步證實SPA檢測的結(jié)果，但敏感性較差，操作繁瑣。但由于MG野毒感染后，最先產(chǎn)生的是IgM，這也為CRD的診斷延遲了時間，一般情況下，在雞感染后3周才能通過HI檢測到特異性抗體；并且HI試驗耗時間較長，且無商品化的試劑，限制了其在生產(chǎn)中的推廣應用。

3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。該方法特異性很高，適合大規(guī)模血清抗體的監(jiān)測，也是一種快速的血清學診斷方法，特別是在當今規(guī)?；B(yǎng)殖的今天，為大量樣本的檢測提供了方便。Talkington等報道用ELISA檢測MG抗體較血凝抑制試驗敏感，而比血清平板凝集試驗敏感性稍低，但特異性強。在方法的改進上面，出現(xiàn)了PPA-ELISA，Dot-ELISA，AC-ELISA，提高了ELISA檢測方法的特異性及敏感性，使在臨床推廣中更具有意義。

（三）分子生物學診斷方法分子生物學方法是近幾年來發(fā)展并且逐漸開始在生產(chǎn)中應用的診斷方法，其主要包括核酸探針和PCR方法，敏感性和特異性均較血清學方法高，并且可用于MG和MS的鑒別診斷。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)費時費力，而血清學方法只是對抗體做出檢測，且存在交叉反應性，所以并不能對CRD做出快速準確的診斷。隨著分子生物學的發(fā)展，對病原的快速診斷技術得到了長足的進步，PCR方法越來越多的應用于支原體感染診斷，套式、半套式、多重、反轉(zhuǎn)錄等PCR方法相繼被用于支原體的檢測。在流行病學應用方面，屈小玲等將PCR方法應用于分子流行病學調(diào)查，取得較好的實驗結(jié)果；鄧顯文等根據(jù)雞毒支原體(MG)強毒株和弱毒疫苗株基因組結(jié)構(gòu)特點設計合成2對特異性引物，可在較短的時間內(nèi)鑒別出MG強毒株和弱毒疫苗株。由此可見分支生物學方法已經(jīng)在雞毒支原體診斷中得到廣泛的關注和應用。

四、MG的疫苗研究進展

疫苗在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖中得到越來越多的應用，其在預防動物疾病中能起到非常重要的作用。研制新型的切實有效的疫苗是防制MG病的重要手段，也是綠色動物產(chǎn)品的發(fā)展趨勢。臨床上用以免疫接種的疫苗主要有兩類：即滅活油乳劑疫苗和弱毒疫苗。

（一）活疫苗由于禽體的抗體水平與保護并不成正相關，機體以T細胞介導的細胞免疫為主，所以弱毒苗的應用，將是當前的重點。活苗研究始于20世紀70年代，國內(nèi)使用的活疫苗為MG康涅狄克F株疫苗，其優(yōu)點就是致病力極弱，且保護力較強，給1、3、20日齡的雛雞滴眼接種，不會引起任何可見的癥狀和氣囊病變，不影響增重?；蠲缪芯恐校毡?、法國、美國分別將G250株、CP株、F株、ts-11株及6/85株制成疫苗應用，其中G250株、CP株由于毒力極度減弱，需頻繁使用，效果不佳?，F(xiàn)在，應用較廣泛的有F株、6/85株和ts-11株。F株菌苗是性質(zhì)相對較溫和的株菌，F(xiàn)株比野毒株致病性低，在雞產(chǎn)蛋之前和被MG野毒感染前使用可降低商品蛋雞的產(chǎn)蛋損失，減少病原體經(jīng)卵傳遞，該菌苗應用于不同年齡的產(chǎn)蛋雞群，以降低MG引起的產(chǎn)蛋下降，MG弱毒常具有置換和傳播功能，F(xiàn)株可通過置換強毒而使感染雞得到保護，但是F株能經(jīng)蛋傳播，它引起的保護作用的生物學機制不涉及定植后進行附位點的競爭或阻斷，并且F株不能阻止MG強毒株的定植。但連續(xù)2年使用F株菌苗免疫后備雞群，MG野毒株即被置換掉。中國獸藥監(jiān)察所用弱毒株F-36制成的活疫苗免疫接種雞，不影響雞體增重，不引起氣囊損傷，接種雞不表現(xiàn)任何臨床癥狀。該疫苗接種雞，免疫保護率達80%，免疫期可達9個月。新近的研究結(jié)果表明，ts-11和6/85弱毒制作的疫苗比F株毒力更弱，對雞和火雞均無毒力，因此，近年來ts-11株和6/85更多的被作為商品化弱毒苗用于雞和火雞，此疫苗對未受MG感染的雞有較好的免疫效果，也可用于火雞的免疫接種，但免疫雞體內(nèi)檢測不到抗體，不易判斷免疫效果，對己感染MG的雞群接種效果不如F株。

Ts-11株是通過化學誘變，經(jīng)過溫度敏感性篩選而得到，ts-11株菌苗在禽與禽之間傳播很差，激發(fā)產(chǎn)生緩慢的低水平的循環(huán)抗體，對MG野毒感染具有保護作用。此菌苗免疫雞群后，終生存在于上呼吸道中，并且能產(chǎn)生長期的免疫力。當禽群附近有易感家禽存在，必須進行MG疫苗免疫時，6/85和ts-11菌苗要好于F株。研究結(jié)果表明，在集約化飼養(yǎng)的條件下，用ts-11己能成功的根除MG。6/85株菌苗是一種凍干苗，在美國主要用于防止商品產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降造成的損失，6/85株菌苗對雞的毒力很小，個體之間很少傳播，并且能抵抗強毒株的攻擊，F(xiàn)株菌苗比6/85和ts-11菌苗取代強毒株的能力強，并且能在多種年齡商品產(chǎn)蛋區(qū)取代野毒株；ts-11株菌苗可以在以前流行過F株的地方免疫其后備母雞群，可取代F株。在美國一些種雞場采用F株和6/85株或ts-11株的聯(lián)合應用，即是利用F株置換野毒株，然后再用毒力更弱的6/85株或ts—11株置換F株，同時減少了弱毒株傳播的范圍，取得了較好的效果。但在國內(nèi)當前MG的疫苗利用方面，并沒有得到廣泛認可。

（二）滅活疫苗20世紀50年代開始，許多禽病工作者即從事滅活苗研究，但效果不佳。Yoder等報道以MG油乳劑滅活苗對15～30日齡雞免疫接種能有效地抵抗強毒株攻擊，但用于10日齡內(nèi)的雛雞，免疫效果不理想。Stone(1987)報道了一種改良的油佐劑苗，可使雛雞免受鼻內(nèi)接種強毒的攻擊，保護產(chǎn)蛋雞群，不造成產(chǎn)蛋率下降，防止雞的氣囊病。宋勤葉等用MG油乳劑滅活苗接種蛋雞，結(jié)果表明無論在試驗攻毒前還是在攻毒后接種，均能有效地降低MG的蛋傳率。SasiPreeyuan等報道，連續(xù)使用油乳劑滅活苗可以達到MG的凈化。滅活苗可起到阻斷經(jīng)蛋傳遞的作用，但不能清除雞體內(nèi)的MG野毒，只能使感染時癥狀減輕，而不能阻止野毒的感染。Abd—Ei—Motelib等 曾 對 F、ts—11和6/85等3個弱毒株以及1個商業(yè)性滅活苗就其免疫效力進行了比較，疫苗接種雞在致病菌株R株氣溶膠攻擊之后，各組剖檢28只雞檢查氣囊病理損傷結(jié)果，F(xiàn)株免疫組只有5只有極其輕度的損傷，損傷平均分為0.18，其它3種疫苗接種雞出現(xiàn)氣囊損傷平均分為1.21～1.89，而滅活疫苗接種組與未接種疫苗的對照組相差無幾，均明顯不如F株。

油佐劑疫苗存在導致注射部位組織增生及吸收慢等缺點，蜂膠是一種天然復合物，含有多種類的類黃酮化合物，包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類以及黃烷酮醇類，具有廣泛地免疫效應，可以全面的啟動機體的免疫防御體系，增強特異性免疫和非特異性免疫，免疫保護期延長。除此外，蜂膠佐劑疫苗注射后對局部無病理性損傷，且吸收快，因此開發(fā)蜂膠佐劑疫苗對預防該病將起到積極的作用。蜂膠苗加倍注射的安全性良好，注射部位無腫脹、無壞死、無感染，雞群生長發(fā)育狀況正常。免疫組在強毒攻擊后，體重增加基本不受影響，對雞群的平均保護率在80%以上，說明蜂膠支原體滅活疫苗能有效防止雞氣囊炎的發(fā)生。

我國雞場中MG感染普遍，預防控制難度很大，因此必須根據(jù)我國的實際情況，加強對該病危害性的認識，采取以疫苗接種為主、藥物治療為輔、加強飼養(yǎng)管理及環(huán)境凈化控制的綜合防治措施，使該病早日得到有效控制。

（三）生物技術疫苗由于目前用來防制MG的滅活疫苗和弱毒疫苗均存在著不同程度的缺陷，再加上MG培養(yǎng)困難和不同地區(qū)分離的毒株抗原性存在差異，常規(guī)疫苗的局限性愈來愈明顯，故利用生物技術手段開發(fā)新型疫苗已勢在必行。新型疫苗包括核酸疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、合成肽疫苗等。

分子生物學研究發(fā)現(xiàn)雞毒支原體結(jié)構(gòu)蛋白中的29kDa、64kDa等蛋白具有良好的免疫原性，而且這些基因已被克隆并進行了序列測定，有望作為基因免疫的良好的免疫原性基因。從理論上講基因免疫是克服眾多疫苗免疫效果不佳或負作用較大的理想手段，但由于目的基因在動物體內(nèi)表達的蛋白質(zhì)分子量小，免疫原性弱，很難誘導動物產(chǎn)生堅強免疫，在這種情況下，人們紛紛尋找新的免疫增強劑。近年來，大量研究證實，白細胞介素-2、白細胞介素-6等是理想的細胞因子類免疫增強劑，而且這些基因已被成功克隆，并在動物體內(nèi)表達成功。因此構(gòu)建IL-2與其它抗原基因共同表達的質(zhì)粒將是新一代DNA疫苗或基因免疫的發(fā)展趨勢，這種方法比IL-2與疫苗混合使用或IL-2基因表達質(zhì)粒和目的抗原基因疫苗混合使用的方法更進一步，以此種方式獲得的重組蛋白，不僅可以提高疫苗的效果，也可以整體上增強動物的免疫力。所以，用MG的某些蛋白基因與雞IL-2或IL-6基因聯(lián)合進行基因免疫很可能對預防雞毒支原體的感染提供新的途徑。雖然針對MG的基因工程疫苗的研究不如一些病毒基因工程疫苗研究的多，也沒有病毒基因工程疫苗研究的深入，但MG基因工程疫苗的研制無疑為預防和控制慢性呼吸道病指引了一個新的研究方向。