李朋波，曹美蓮，楊六六，劉惠民，李燕娥

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院，山西太原030006）

商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物自從1996年問世以來，在生產(chǎn)上已被廣泛地應(yīng)用。2009年，世界上有25個國家種植了1.34億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，其中，以轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜為主要種類[1-2]。除了我國具有絲氨酸蛋白酶抑制劑基因、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)基因棉花外，全世界范圍內(nèi)商業(yè)化應(yīng)用的主要抗蟲基因是蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因[3]。轉(zhuǎn)Bt基因棉花在全球棉花生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。在我國，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉是應(yīng)用最成功、面積最廣的抗蟲棉類型，1997—2009年，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉累計推廣面積達2 100萬hm2，其中2009年達370萬hm2，占全國棉花種植面積的68%[1]。抗蟲棉的種植不僅有效控制了棉鈴蟲對棉花的為害，而且高度抑制了棉鈴蟲在玉米、大豆、花生和蔬菜等其他作物上的發(fā)生與為害[4]。

1 單一轉(zhuǎn)Bt基因作物的應(yīng)用風險

Bt（Bacillus thuringiensis）基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離的編碼殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因，是目前研究最為深入、應(yīng)用范圍最廣的殺蟲基因。然而，在全世界除轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物外，還有90%以上的微生物殺蟲劑采用Bt制劑，因此，單一的殺蟲毒蛋白就極有可能誘發(fā)害蟲對Bt基因產(chǎn)生抗性。在田間生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，高劑量使用Bt殺蟲劑的地方有一些鱗翅目害蟲已經(jīng)產(chǎn)生了抗性，而實驗室研究也表明，經(jīng)過多代的篩選，害蟲產(chǎn)生了隱性的抗性基因[5-9]。長期種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花，害蟲就可以對殺蟲毒蛋白產(chǎn)生抗性。我國種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉已達十余年，在抗蟲棉種植面積較大的棉區(qū)，棉鈴蟲的抗性已提高5倍左右[10-12]。在國外，常采用種植非轉(zhuǎn)基因作物作為“庇護所”來延緩害蟲對Bt產(chǎn)生抗性，但我國單個農(nóng)戶的種植面積比較小，采用種植非轉(zhuǎn)基因植物作為“庇護所”的方法在執(zhí)行上困難比較大，延緩害蟲抗性的產(chǎn)生是一個長期利用轉(zhuǎn)基因棉花的重要挑戰(zhàn)。同時，盡管Bt基因δ-內(nèi)毒素是有效的殺蟲蛋白，但是在實際應(yīng)用中仍有許多重要農(nóng)作物害蟲對殺蟲晶體蛋白毒素不敏感，如為害50多種農(nóng)作物的小地老虎。小地老虎取食棉苗，造成缺苗斷壟，往往給棉花生產(chǎn)帶來較大的損失，因此，對于其他害蟲的控制也成為當前抗蟲棉培育的重要方向之一，利用具有不同于ICPs殺蟲機理的新型殺蟲蛋白發(fā)展抗蟲棉是棉花生產(chǎn)的當務(wù)之急。

2 VIP殺蟲蛋白

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉問世以來，科學家為了拓寬基因抗蟲譜及提高抗蟲性，對包括Bt基因家族在內(nèi)的其他類型的抗蟲基因進行了廣泛的研究，并取得了可喜的進展。研究發(fā)現(xiàn)，在蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)生長階段，可分泌另一種非δ-內(nèi)毒素的殺蟲蛋白VIPs（Vegatative insecticidal protein，VIP）[13]。VIPs是芽孢桿菌在對數(shù)生長期分泌的一類新型殺蟲毒素蛋白，被稱為第二代殺蟲蛋白，主要分為VIP1，VIP2和VIP3等3種[14]。VIP1和VIP2構(gòu)成二元毒素，對鞘翅目葉甲科的昆蟲具有殺蟲特異性[15]，而VIP3對鱗翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性[13]。

在VIP3中已發(fā)現(xiàn)多個類型，其中，VIP3A蛋白最早由Estruch等報道，是一種廣譜殺蟲蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)的VIP3A蛋白有8類[16]。VIP3A對小地老虎（Agrois ipsilon）有高殺活性，比毒蛋白Cry1Ac毒力高260倍；對草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、煙芽夜蛾（Heliothis virescens）、美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）、玉米螟（Pyrausta nubilalis）等鱗翅目害蟲有較好殺蟲活性[13，17]。一些研究表明，對不同的殺蟲基因重組后表達的融合蛋白亦可增強對鱗翅目害蟲的毒性，單獨的VIP3Ac1和VIP3Aa1對歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）殺蟲活性極低，但將2個基因重組后表達了一種嵌合蛋白VIP3AcAa，則對歐洲玉米螟表現(xiàn)出很高的殺蟲活性[18]。

VIP3與已知的ICPs沒有序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性[13]，ICPs對昆蟲的毒殺作用主要是由于芽孢形成期產(chǎn)生的伴孢晶體導(dǎo)致的[19]；VIP3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用，通過誘發(fā)中腸細胞凋亡，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。VIP3與廣泛使用的Cry晶體殺蟲毒素殺蟲機理不相同，這是由于在鱗翅目昆蟲中，VIP3的氨基肽酶N端與鈣黏蛋白類似物的受體不同于Cry1Ab或Cry1Ac[20]。通過比較VIP3對敏感和抗Cry1Ac的粉紋夜蛾的殺蟲活性，VIP3Ab2，VIP3Aa1和VIP3AbAa對敏感和抗性昆蟲都具有很高的殺蟲活性[21]，且對Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的煙芽夜蛾品系也表現(xiàn)對VIP3A蛋白的高度敏感性[22]，這說明VIP3A和Cry1A這2種蛋白無交互抗性。因此，VIP3可用于抗性害蟲的防治和研制構(gòu)建高效、廣譜的殺蟲蛋白基因。

3 轉(zhuǎn)vip3基因作物研究與應(yīng)用

3.1 轉(zhuǎn)vip3基因作物的應(yīng)用進展

先正達公司在全球最早開展了vip3轉(zhuǎn)基因研究，已將vip3成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因殺蟲植物的構(gòu)建，并在棉花和玉米中首先得到應(yīng)用。2003年研制成功表達VIP3A毒蛋白的棉花品種COT102，隨后又采用轉(zhuǎn)vip3A基因棉花COT102與轉(zhuǎn)cry1Ab基因棉花COT67B雜交選育而成VipCotTM棉花[23]，是首個含有VIPs和Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花。2007年培育出轉(zhuǎn)vip3Aa 20的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。目前，美國已成功培育含有VIP3A的玉米Agrisure VipteraTM3111[24]，是集合轉(zhuǎn)vip3A基因玉米Agrisure Viptera與抗蟲、抗除草劑玉米Agrisure 3000GT的優(yōu)良性狀選育的新品種，這一品種可以非常有效地控制影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的14種地上及地下害蟲，這在未來的玉米生產(chǎn)中必將發(fā)揮重要作用。2010年，先正達公司研制的含VIP3A蛋白的棉花和玉米獲得美國環(huán)境保護署的批準[25-26]，可將含有VIP3A蛋白的轉(zhuǎn)基因作物用于防治對Bt基因產(chǎn)生抗性的鱗翅目害蟲，同時，采用這種棉花和玉米還可以毒殺田間大多數(shù)的鱗翅目害蟲，極大地拓寬了轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲譜。預(yù)計到2011年，美國將開始種植含有VIP3A蛋白的棉花品種和玉米雜交種。在國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椀馁Y助下，我國也積極開展了對vip3基因的研究與利用。浙江大學與山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所等單位合作，利用國內(nèi)獲得的新型vip3基因及其改造成果，構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組vip3與cry1A融合基因，可望實現(xiàn)對棉花、玉米、水稻等主要作物鱗翅目害蟲廣譜高抗的育種目標。

3.2 轉(zhuǎn)vip3基因作物殺蟲效果

轉(zhuǎn)vip基因植物可以提高植物的抗蟲性，減少損失。Estruch等于1998年成功地將vip3A（a）基因與不同的啟動子（如PEPC，Ubi和MTL等）構(gòu)建成表達載體，通過粒子轟擊法導(dǎo)入玉米愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因玉米對小地老虎和草地夜蛾的殺蟲效果都很好；后來又將轉(zhuǎn)vip3A基因玉米與轉(zhuǎn)cry1B基因、轉(zhuǎn)cry1Ab及轉(zhuǎn)cry9C基因玉米分別雜交，得到的雜交后代中有部分植株對歐洲玉米螟和草地夜蛾均有殺蟲效果[17]。同時，vip3A基因也被轉(zhuǎn)化到棉花中。飼喂試驗表明，vip3A對多種鱗翅目害蟲表現(xiàn)了高的抗性[27]。大田接蟲試驗表明，含有VIP3A的棉花品系對甜菜夜蛾與草地夜蛾的毒殺作用強于Cry1Ab棉花品系，而對于煙芽夜蛾的作用則相反[28]。采用VIP3A與Cry1Ab共表達的棉花凍干組織進行生測，結(jié)果表明，含4%的組織可完全毒殺煙芽夜蛾，含0.8%的組織飼喂幼蟲平均死亡率達97.3%，2種濃度對棉鈴蟲都具有100%的毒殺作用。由于大齡幼蟲具有更高的耐受性，因此，采用1齡期和4齡期棉鈴蟲飼喂VIP3A與Cry1Ab共表達的葉片，表明對這2種幼蟲都具有100%的殺蟲效果。大田接蟲試驗表明，7 d后轉(zhuǎn)基因棉花中煙芽夜蛾和棉鈴蟲的死亡率達99.9%以上，完全抑制了害蟲的發(fā)生[23]。將cry1Ab與vip3H融合基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因各個組織均可以表達Cry1Ab與VIP3H蛋白，表達量從多到少依次為葉片、莖稈、根和種子，轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻在小規(guī)模田間試驗時對稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medialis）具有良好的抗性[21]。

3.3 轉(zhuǎn)vip3基因作物對環(huán)境生物的影響

對于新型轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)，人們關(guān)注的另外一個焦點問題是轉(zhuǎn)VIP3基因作物對環(huán)境生物是否安全。采用轉(zhuǎn)VIP3A基因玉米飼喂肉雞試驗表明，經(jīng)過49 d的喂養(yǎng)，VIP3A對公雞與母雞宰殺產(chǎn)量沒有明顯影響，臨床血液學分析也沒有因飼喂轉(zhuǎn)vip3A基因玉米而產(chǎn)生影響[29]。通過研究轉(zhuǎn)基因玉米田的節(jié)肢動物群落，表達VIP3A蛋白的玉米田中非靶標節(jié)肢動物整體的生物多樣性和群體水平與常規(guī)玉米沒有顯著的差異，然而，在轉(zhuǎn)Bt基因玉米田卻有部分物種發(fā)生了顯著的改變[30-31]。而對轉(zhuǎn)基因玉米MIR162進行研究，發(fā)現(xiàn)其對環(huán)境生物和人類健康均無明顯的影響[32]。從現(xiàn)有研究結(jié)果看，轉(zhuǎn)vip3基因植物對人類、家禽及田間非靶標節(jié)肢動物不具有危害性的影響，可以安全地用于作物害蟲的防治。

綜上所述，轉(zhuǎn)Bt基因棉花、玉米等作物為防治棉鈴蟲與玉米螟等害蟲起到了重要作用，新型轉(zhuǎn)vip3基因作物具有防治對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性的害蟲及擴大抗蟲譜的優(yōu)勢，為了延長轉(zhuǎn)Bt基因作物的田間應(yīng)用壽命，應(yīng)該進一步研究2種轉(zhuǎn)基因作物的科學合理搭配種植方案，降低轉(zhuǎn)基因作物“失效”的風險，確保作物安全高效生產(chǎn)。

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