韓雅慧，陶寧萍

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

甘草又名甜草、蜜草、美草等，其藥用部位為豆科（Leguminosae）植物甘草屬（Glycyrrhiza）甘草（Licorice）的根及根狀莖[1]。據(jù)《中華人民共和國藥典》2000年版記載，甘草有3個品種，即烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensi Fisch）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）[2]。甘草有效成分包括黃酮類、三萜類、多糖等。迄今為止，已從甘草中分離出150多個黃酮類化合物，主要包括黃酮類、黃酮醇類、查爾酮類、雙氫黃酮類、雙氫查爾酮類等[3]。甘草黃酮具有明顯的抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保肝等藥理作用，尤其在發(fā)現(xiàn)它具有抗艾滋病病毒[4]作用后，甘草黃酮類化合物的研究引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。

本文綜述了甘草黃酮的提取方法及其抗氧化能力測定方法的研究現(xiàn)狀，以期為甘草黃酮類成分的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 甘草黃酮的提取方法及比較

1.1 甘草黃酮的提取方法

甘草黃酮的提取方法很多，基本原理都是通過物理、化學(xué)方法破壞甘草的細胞壁，再根據(jù)甘草黃酮的極性及溶解性能的差異進行提取分離。1.1.1 溶劑萃取法 它包括無機溶劑萃取法和有機溶劑萃取法。其主要原理是利用甘草黃酮能溶于堿水或甲醇等有機溶劑的特性來提取甘草黃酮。其中，有機溶劑萃取法是目前國內(nèi)外提取甘草中黃酮類物質(zhì)最為廣泛的方法，可用冷浸法或加熱抽提法提取，乙醇和甲醇是普遍采用的浸提液。但建明等[5]以NaOH水溶液為浸提液，正交設(shè)計提取甘草渣中黃酮類化合物得出，最佳提取工藝為0.2 mol/LNaOH，料液比為1∶14，提取溫度90℃，提取時間0.5 h。劉曉風(fēng)等[6]利用乙醇回流法提取市售甘草黃酮，正交試驗得到最佳提取工藝為料液比1∶20，提取溫度85℃，提取時間3 h，乙醇濃度75%，提取率達到2.49%。楊慧等[7]選擇NaOH和乙醇的混合溶液作為浸提液，利用回流法提取內(nèi)蒙古產(chǎn)甘草渣中黃酮，試驗獲得的最佳工藝條件為堿醇（NaOH濃度0.4 mol/L，乙醇濃度75%）比為1∶2，料液比1∶30，回流時間3 h，回流溫度95℃，提取率達到4.21%。田慶來等[8]以三烷基氧化膦（Trialkylphosphine Oxide，TRPO）石油醚溶液為浸提液，對市售甘草片進行黃酮提取，正交試驗表明，TRPO濃度影響總黃酮提取率程度大于有機相與水相的體積比（A/O），總黃酮提取率隨A/O的增大而減小，隨浸提液濃度的增大迅速提高，通過此法可實現(xiàn)水溶性甘草黃酮和甘草酸的分離。

1.1.2 超聲輔助溶劑提取法 其原理是利用超聲波使植物組織在溶劑中瞬時產(chǎn)生空化泡崩潰，進而細胞破裂，溶劑與植物細胞內(nèi)部成分相互滲透，增加了黃酮在溶劑中的溶解。曾超珍等[9]利用此法通過正交試驗提取市售甘草中的黃酮得出，在超聲功率385 W，80%乙醇，料液比1∶15，提取時間8 min的提取條件下，黃酮提取率達到6.23%。劉紅等[10]研究了超聲時間對人工栽培2年生烏拉爾甘草中黃酮提取率的影響，結(jié)果表明，在室溫下超聲提取80 min較合適。另外，王應(yīng)強[11]、何璐[12]、李炳奇[13]等分別對不同甘草品種進行超聲輔助提取的工藝研究，表明超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于甘草黃酮的提取。

1.1.3 微波輔助溶劑提取法 微波可直接作用于分子，使其熱運動加劇，溫度升高，這種熱效應(yīng)使微波穿透到介質(zhì)內(nèi)部，加速細胞壁的破壞，使甘草黃酮類物質(zhì)更快地被分離提取出來。孫萍等[14]首次使用微波法從甘草中提取黃酮，測得黃酮提取率為1.721%。張明華等[15]采用微波輔助乙醇提取法對烏拉爾甘草進行黃酮提取的條件優(yōu)化，單因素試驗結(jié)果確定最佳工藝條件為：料液比為1∶18，預(yù)浸泡時間1 h，微波功率420 W，乙醇濃度70%，微波時間50 s，微波次數(shù)1次，黃酮提取率為4.080 7%。史高峰等[16]設(shè)計正交試驗，采用微波輔助法對甘草渣（寧夏產(chǎn)，1年生）中總黃酮提取方法進行研究，結(jié)果顯示，在80%乙醇，料液比1∶10，微波功率300 W，微波輔助回流60 min的條件下，黃酮提取率為0.408%。張夢軍等[17]采用均勻設(shè)計來優(yōu)化微波提取市售甘草中黃酮的試驗條件，并且將微波法與水浸提法進行了比較，微波法優(yōu)化結(jié)果為：料液比1∶8，乙醇濃度38%，微波功率288 W，加熱時間1 min，通過試驗發(fā)現(xiàn)微波法的提取效率明顯優(yōu)于水浸提法。

1.1.4 超臨界流體萃取法（SFE） 在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來，并且通過控制CO2的壓力和溫度來控制溶解度和蒸汽壓這2個參數(shù)來進行分離。超臨界萃取通過使植物細胞壁高度破碎，增加黃酮類物質(zhì)與溶劑的接觸面積和萃取通道，同時還使黃酮與纖維素結(jié)合力降低，從而提高萃取率。付玉杰等[18]以萃取溫度、萃取壓力、夾帶劑用量、CO2流量、分離壓力和分離溫度為指標(biāo)，確定超臨界CO2萃取烏拉爾甘草中黃酮的最佳工藝條件，并以此最佳工藝與乙醇提取法進行比較，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取法的甘草黃酮提取率比溶劑提取法高2.2倍。付玉杰等[19]還采用單因素試驗對甘草地上部分（莖葉）的超臨界CO2提取工藝進行了研究，以總黃酮提取率和含量為指標(biāo)，總黃酮提取率達到2.09%，黃酮含量為5.42%，為工業(yè)化SFE-CO2法生產(chǎn)粗甘草黃酮提供了有價值的工藝參數(shù)。

1.1.5 復(fù)合酶法 它是在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物藥材細胞壁的構(gòu)成，利用酶反應(yīng)所具有的高度專一性等特點，選擇相應(yīng)的酶，將細胞壁水解或降解，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸于溶劑中，從而達到提取細胞內(nèi)有效成分的目的。張志東等[20]利用復(fù)合酶法結(jié)合醇提法提取甘草廢渣中的黃酮，確定了復(fù)合酶處理的條件，即：纖維素酶添加量833.5 nkat/mL，果膠酶1 667 nkat/mL，反應(yīng)pH 6.0，溫度55℃，作用120 min，最終提取率達到2.25%，該法較利用醇提法提取甘草渣中黃酮得率提高了25%以上。王蕓蕓等[21]采用纖維素酶和果膠酶從甘草渣中提取甘草總黃酮，并與醇提法相比較，結(jié)果得出，復(fù)合酶法提取的游離總黃酮含量提高了1.15倍。

1.1.6 閃式提取法 其主要原理是在適當(dāng)溶劑存在條件下，利用高速機械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細胞組織，使細胞組織內(nèi)部的有效成分與溶劑充分接觸，快速溶解轉(zhuǎn)移，在短時間內(nèi)達到內(nèi)外溶解平衡。鄧引梅等[22]對比研究了閃式提取、索氏抽提、攪拌提取、超聲波提取對脹果甘草葉總黃酮的提取效果，并利用正交試驗對提取工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，用閃式提取法提取時間短，提取溶劑用量少，最佳提取工藝為：料液比1∶40，乙醇濃度70%，提取時間6 min，黃酮提取率為2.917%。此后，鄧引梅等[23]又在單因素試驗基礎(chǔ)上探索了響應(yīng)面法確定閃式提取甘草葉中總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)的可行性，最佳工藝條件為：料液比1∶40.3，乙醇濃度70.2%，提取時間5 min，在此工藝條件下，總黃酮的提取率達到2.91%，與模型預(yù)測值基本相符。

1.1.7 半仿生提取法（Semi-bionic Extraction method，SBE法） 其原理是從生物藥劑學(xué)的角度，模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運的原理，為經(jīng)消化道給藥的中藥制劑創(chuàng)立一種新的提取工藝。孫秀梅等[24]對甘草飲片顆?；芯?，SBE提取工藝將水浸提提取工藝中pH 7.0的水分別改用pH 2.0的水作第1煎，pH 6.5的水作第2煎，pH 9.0的水作第3煎，制得SBE液，并以甘草次酸、甘草總黃酮、浸膏量為指標(biāo)，將2種方法進行比較，研究表明，SBE法優(yōu)于水浸提法。徐萍[25]將方藥分成混煎組和桂枝、甘草單煎混合組，用半仿生提取法提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油、干浸膏的含量測定及50%乙醇精制液的HPLC指紋圖譜比較，結(jié)果表明，除干浸膏含量單煎混合液與混煎液相近外，其余4個指標(biāo)成分的含量，混煎液均明顯高于單煎混合液。

1.2 7種提取方法的優(yōu)缺點比較[26]

上述方法各有優(yōu)缺點（表1），在提取甘草黃酮時，多采用2種或2種以上的方法輔助提取，如超聲-微波協(xié)同萃取法[27]、復(fù)合酶法及微波法[28]等。汪河濱等[29]比較了溶劑提取法、超聲波、微波、超聲-微波協(xié)同萃取4種不同提取方法提取甘草黃酮的效果，結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同萃取法提取甘草黃酮效果最好。

表1 7種提取方法的優(yōu)缺點比較

2 甘草黃酮的抗氧化能力測定方法[30-31]

國內(nèi)外對抗氧化劑的研究十分重視，近幾年，美國、日本及歐洲國家均將其作為功能食品素材的研究重點，并已建立了多種測定甘草黃酮抗氧化活性的方法。現(xiàn)將常用的方法分述如下。

2.1 國標(biāo)法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.37—1996中食用油過氧化值（POV）的檢驗方法進行測定。崔永明等[32]使用此法測定了甘草總黃酮對4種油脂的抗氧化作用，結(jié)果顯示，甘草黃酮可以作為油脂的抗氧化劑，并且其對豬油的抗氧化效果更好。朱少華等[33]對甘草查爾酮抗脂質(zhì)過氧化及清除自由基的能力進行研究，發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用，其作用機制可能是對羥基自由基（·OH）的直接清除作用所致。

2.2 FRAP法[34]

FRAP（鐵離子還原能力，ferric ion reducing antioxidant power）法又稱氧化還原法，其原理是甘草黃酮中的抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與Fenton類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，反應(yīng)的結(jié)果以Fe2+的當(dāng)量或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的抗氧化能力表示。該法具有快速簡便，易于操作，重復(fù)性好等優(yōu)點。李銘花等[35]研究甘草4種不同極性溶劑提取物中黃酮和總酚含量，并采用FRAP法測定各提取物的抗氧化能力，結(jié)果顯示，極性較大的有機溶劑的對應(yīng)提取物還原能力較強，且甘草總酚、黃酮含量與其抗氧化活性間存在較好線性關(guān)系。吳碧華等[36]研究了甘草黃酮對Fenton反應(yīng)生成的·OH具有較強的直接清除作用，其清除·OH的IC50（自由基被抑制1/2時抑制劑的濃度）是甘露醇的1/255，其抑制·OH生成的IC50是甘露醇的1/139，提示了甘草總黃酮有可能作為一種新的天然抗氧化劑。此后，吳碧華等[37]又研究了甘草黃酮對超氧陰離子（O2-）和·OH的清除和抑制作用，結(jié)果表明，甘草黃酮不僅對·OH具有清除作用，且清除率與藥物濃度呈正相關(guān)，而且對·OH的生成速度也具有明顯的抑制作用，療效明顯優(yōu)于維生素E和甘露醇。

2.3 DPPH法[38]

DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，抗氧化物質(zhì)可以使其還原、顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測得抗氧化劑的活性。趙麗娜等[39]對新疆產(chǎn)3種甘草渣中甘草黃酮含量及其抗氧化活性進行了比較研究，結(jié)果顯示，3種甘草渣中總黃酮含量以烏拉爾甘草渣最高，其DPPH清除率達到4.08%。羅峰等[40]研究了光果甘草、烏拉爾甘草、脹果甘草3種甘草品種的總黃酮提取方法，DPPH法測定其抗氧化活性，并分析了甘草品種、應(yīng)用微波處理、甘草放置時間、提取溫度對甘草抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示，除提取溫度外，其他3個因素對甘草抗氧化活性有較大影響。

2.4 鄰苯三酚自氧化法[41]

在堿性條件下，鄰苯三酚能迅速自氧化，釋放出O2-·，生成帶色的中間產(chǎn)物，且鄰苯三酚自氧化速率與生成O2-·的濃度呈正相關(guān)，中間產(chǎn)物在420 nm波長有強烈光吸收。抗氧化劑能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，故可通過紫外可見光分光光度法來定量測定抗氧化劑在此體系中對O2-·的清除作用，間接評價抗氧化劑的抗氧化能力。索金玲等[42]采用此法評價了石榴葉總黃酮提取物的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，石榴葉總黃酮抑制鄰苯三酚自氧化能力高于維生素C。楊玲等[43]利用超聲-微波系統(tǒng)萃取烏拉爾甘草中多糖類物質(zhì)，并利用DPPH法、FARP法及鄰苯三酚自氧化法分別測定甘草多糖對DPPH·，·OH和O2-·的清除能力，結(jié)果表明，在同等濃度下，甘草多糖對DPPH·清除能力強于維生素E但低于維生素C，清除·OH能力比O2-·強。

2.5 熒光分光光度法[44]

熒光法主要檢測對羥基的抗氧化能力（Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity，HORAC），其原理是過氧化氫自由基對熒光探針具有氧化作用，并使得探針的熒光減弱，當(dāng)有抗氧化劑存在時，探針的熒光減弱被抑制。根據(jù)這一特性，可測定樣品對氧自由基清除活性，測定結(jié)果以TroloxTM（標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑）當(dāng)量表示，具體在衰變曲線中，常使用AUC（曲線下面積）作為最終指標(biāo)。WANG[45]主要研究了L-苯氨酸-Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥基自由基的最佳條件，并測試了赤芍、鉤藤、姜黃、炒蒺藜4種黃酮類中草藥水提物的抗氧化活性，建立了一種測定中草藥抗氧化活性的方法。李滿秀等[46]研究了山楂、槐米、沙棘莖皮3種樣品提取物對O2-·的清除作用，結(jié)果顯示，3種樣品對O2-·的清除能力與提取物濃度均有明顯的量效關(guān)系，且它們清除O2-·的能力依次為：槐米＞沙棘＞山楂。

3 前景與展望

目前，市場上已經(jīng)有很多的黃酮產(chǎn)品，比如黃酮片、六味黃酮茶以及各種黃酮類藥品。甘草黃酮雖然具有明顯的抗氧化作用，可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生，對胃潰瘍、肝損害、病原微生物、酶及抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)等方面都有明顯的藥理作用，但甘草黃酮類的產(chǎn)品卻很少，所以使用先進的分析分離技術(shù)，特別是對甘草黃酮類化合物中單一成分分離純化，可為新藥、新產(chǎn)品資源的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

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