周 劍,張建湘*,湯 健,李全利,周 健,蔡華瓊

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,合肥 230032；2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；3安徽口腔疾病研究省級實(shí)驗(yàn)室)

自體骨移植是臨床治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn),但存在對患者的二次創(chuàng)傷以及取材量少的缺點(diǎn),異體骨則存在著一定的免疫排斥反應(yīng)以及疾病的傳播。人工骨的研究為解決這個(gè)難題帶來了希望[1,2]。2009年 3～10月,本研究擬用瓊脂溶膠(AG)調(diào)控羥基磷灰石(HA)晶體的生長,合成新型 AG-HA納米復(fù)合骨修復(fù)材料,通過制作兔脛骨臨界性骨缺損動物模型來評價(jià)其促進(jìn)骨缺損修復(fù)的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康新西蘭大白兔 20只,購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,體質(zhì)量 2.5～3.5 kg,雌雄不限。其中實(shí)驗(yàn)組 16只,術(shù)后 2、4、8、12周各 4只,4只為空白對照組。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置參照國家科學(xué)技術(shù)部 2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 試劑 溶液沉淀合成、非燒結(jié) HA粉末(微米級,四川大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院材料研究室提供)；AG(基因科技(上海)有限公司)；其他試劑為分析純試劑。

1.3 復(fù)合材料的合成 將一定量的非納米 HA的鹽酸溶液,加入一定量的 AG中,調(diào)整反應(yīng)體系的pH值為 7～8,然后將反應(yīng)形成的復(fù)合物冷凍干燥后即得 AG-HA復(fù)合材料。

1.4 動物模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)制備兔脛骨上端腔隙性骨缺損模型[3]。3%戊巴比妥鈉按 1 mg/kg行耳緣靜脈注射麻醉,采用靜脈靜滴針術(shù)中留置靜脈通道補(bǔ)液。待麻醉效果滿意后,固定四肢,剪除雙膝以下小腿的兔毛,碘伏消毒,鋪洞巾,以膝關(guān)節(jié)以下脛骨內(nèi)髁的平臺為基點(diǎn),做一約 3 cm縱行切口。分離軟組織,仔細(xì)剪除內(nèi)髁平臺周圍骨膜,用口腔科磨鉆切除脛骨內(nèi)髁的平臺關(guān)節(jié)面以近皮質(zhì)骨約 1.5 cm×0.8 cm大小,刮匙刮除骨髓及松質(zhì)骨,沖洗后仔細(xì)止血。實(shí)驗(yàn)組填塞實(shí)驗(yàn)材料,壓緊填實(shí),對照組未處理。全層縫合皮膚,外用手術(shù)切口敷料包裹切口。術(shù)中采用靜脈通道補(bǔ)液 250 ml,配80萬 U青霉素鈉,術(shù)后第 3天靜脈補(bǔ)液 250 ml,配 40萬 U青霉素鈉,術(shù)后未予以固定,籠養(yǎng),常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo):①X線檢查:于術(shù)后 2、4、8、12周處死動物后取雙下肢拍片,觀察骨缺損愈合情況、骨痂密度等。攝片條件為 0.4 s,50 mA,40 kV。②病理切片:取下來的骨缺損樣本,甲醛固定后,甲酸常規(guī)脫鈣石蠟包埋,蘇木精—伊紅(HE)切片染色,Olympus光學(xué)顯微鏡觀察觀察組織形態(tài)學(xué)變化。次要觀察指標(biāo):大體觀察:包括術(shù)后切口愈合情況、肢體活動、骨折端與材料界面及軟組織界面的情況。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件和術(shù)后飼養(yǎng)水平,合理改進(jìn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間,家兔均成活至實(shí)驗(yàn)要求時(shí)間。納入實(shí)驗(yàn)動物 20只,進(jìn)入結(jié)果分析 20只。傷口均Ⅰ期愈合,雙側(cè)觀察指標(biāo)均大體相同。

2.2 大體觀察 實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后第 2周:手術(shù)傷口生長良好,無炎性反應(yīng)。處死后取材觀察骨缺損表面,見植入材料表面有纖維組織膜覆蓋,與周圍組織界限仍然較清晰,接觸較好,無炎癥反應(yīng)。第 4周:手術(shù)切口已經(jīng)完全愈合。處死后取材見植入材料顏色較之前變淡,與周圍骨組織界限已經(jīng)模糊,較第 2周時(shí)與骨缺損區(qū)結(jié)合緊密,無炎癥反應(yīng)表現(xiàn)。第 8周:手術(shù)切口已正常。處死后取材見植入材料顏色較之前變淡,植入物材料的硬度與周圍骨組織的硬度已接近,缺損周圍有大量骨痂生成,大體觀察骨缺損已明顯減小。第 12周:處死后取材見骨缺損區(qū)已骨性愈合,未見纖維組織長入,有血管孔生成。空白對照組:第 12周:軟組織增生充填覆蓋骨缺損,未形成骨性愈合。標(biāo)本剖面見骨缺損髓腔形成空腔,髓腔兩端封閉,未有新生骨長入。

2.3 X線檢查 實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后第 2周:骨缺損區(qū)密度輕度增高,但仍較清楚。骨折斷端周圍有毛玻璃樣骨組織形成。第 4周:骨缺損面積減少,骨痂密度增高,呈云霧狀,骨痂基本能將缺損處充填,骨缺損區(qū)基本上已模糊。第 8周:骨缺損區(qū)密度較之前明顯增高,骨折周圍界限模糊。第 12周:缺損區(qū)已經(jīng)基本愈合,密度稍降低,骨缺損邊界已看不清。空白對照組:第 12周:缺損區(qū)邊界硬化,境界清晰,缺損區(qū)密度不均勻。

2.4 組織學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后第2周:HE切片見大量的骨髓基質(zhì)細(xì)胞形成,無明顯的炎癥反應(yīng)。成骨活躍,新生骨基質(zhì)周圍包繞著大量成骨細(xì)胞,可見片狀、條索狀、網(wǎng)狀的新生骨基質(zhì)。第 4周:新骨形成明顯增多。大量的網(wǎng)狀編織骨形成,鈣化比第 2周明顯較強(qiáng),大量的成骨細(xì)胞包埋在骨陷窩中成為骨細(xì)胞。膜性成骨及軟骨內(nèi)成骨均可見。新形成的骨開始早期塑形改變,可見破骨細(xì)胞。第 8周:編織樣骨組織進(jìn)一步成熟,骨小梁趨于有序性,纖維的排列方向表現(xiàn)出負(fù)荷的適應(yīng)性改建。第 12周:新生骨組織進(jìn)一步成熟,表現(xiàn)為松質(zhì)骨逐漸向密質(zhì)骨的改建,出現(xiàn)板層骨結(jié)構(gòu),可見小血管,骨創(chuàng)邊緣與原有正常骨組織相接,表現(xiàn)成骨的連續(xù)性?？瞻讓φ战M:第 12周:髓腔無明顯成骨現(xiàn)象,大量纖維組織及炎癥細(xì)胞浸潤,骨折斷端未愈合。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從大體觀察、X線片攝片、組織學(xué) 3個(gè)方面評價(jià)了新型骨修復(fù)材料的骨修復(fù)效果。大體觀察此種硬組織修復(fù)材料的標(biāo)本在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均具有良好的成骨效果,骨痂形成,表面硬化,12周時(shí)表面已形成骨連接,并見骨的滋養(yǎng)血管長入。而對照組 12周時(shí)表面有纖維組織覆蓋,剖面圖見骨髓腔硬化封閉形成空腔,未有新骨形成。X線片證明,實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有骨痂形成,骨缺損區(qū)形成毛玻璃樣模糊影,且隨著時(shí)間的推移,骨缺損區(qū)的邊界越模糊,到 12周時(shí)已經(jīng)不能看到缺損,符合大體觀察標(biāo)本所看到的情況。而對照組骨缺損區(qū) 12周時(shí)周圍骨皮質(zhì)硬化,缺損清晰,表明未有新生骨形成,骨缺損未得到有效修復(fù)。組織學(xué)觀察術(shù)后不同時(shí)期染色切片,隨著骨修復(fù)的進(jìn)程,實(shí)驗(yàn)組材料含無機(jī)材料較多,制片過程中在甲酸的作用下已經(jīng)溶解,周圍有新鮮骨小梁形成,12周時(shí)骨小梁重建排列有序,板狀骨形成,而對照組斷端有大量纖維結(jié)締組織及炎性細(xì)胞浸潤,骨折斷端封閉,新骨形成少,未形成骨性連接。

本研究通過以上 3個(gè)方面,表明 AG-HA復(fù)合材料可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。其可能的機(jī)理如下:實(shí)驗(yàn)材料是通過 AG與 HA的復(fù)合,在堿性條件下,HA晶體在 AG的調(diào)控下重新生長,獲得的新型有機(jī)—無機(jī)納米復(fù)合物。AG是一種多糖且親水的膠體,加熱使其部分醛的結(jié)構(gòu)被氧化,形成羧基,其中的硫酸根、以及形成的羧基,可以與溶液中的 Ca2+發(fā)生鍵合反應(yīng),在過飽和的鈣磷溶液中,介導(dǎo) AG的成核、生長。可以作為 HA晶體生長的模板,類似骨組織中膠原蛋白等調(diào)控 HA晶體的生長。同時(shí)取代物的類型、數(shù)量、位置將會嚴(yán)重影響到 AG的物理性質(zhì)和功能[4]。由于 HA的引入,這種連接點(diǎn)區(qū)域可能被破壞,使凝膠形成了相對較弱的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)束,溫度降至室溫后,復(fù)合物膠凝強(qiáng)度降低。另外,p H通過影響多糖分子間氫鍵形成也導(dǎo)致瓊脂凝膠性的破壞[5],使納米 HA晶體能分布均勻,復(fù)合物的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。納米的 HA晶體與天然的 HA結(jié)構(gòu)類似[6,7],為納米級的、低結(jié)晶的含碳酸根的 HA晶體,晶粒發(fā)育不完善。HA作為人體骨骼最理想的替代材料,其晶粒越細(xì),生物活性越高。通過掃描電鏡和透射電鏡可觀察到 AG-HA復(fù)合物上有大量納米級 HA晶體,具有疏松多孔的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)非常有利于細(xì)胞的黏附和生長。在與骨基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中也顯示了良好的細(xì)胞相容性。

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