朱 泓，楊祖菁

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200092)

軟骨發(fā)育不全的產(chǎn)前診斷進(jìn)展

朱 泓，楊祖菁

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200092)

軟骨發(fā)育不全是最常見的遺傳性侏儒，作為一種嚴(yán)重的遺傳性疾病，該病發(fā)生后難以治療。近年來，由于產(chǎn)前診斷方法及分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，軟骨發(fā)育不全的產(chǎn)前基因診斷成為可能。本文就該病的產(chǎn)前診斷技術(shù)尤其是基因診斷這方面進(jìn)展進(jìn)行綜述。

軟骨發(fā)育不全;胎兒;基因診斷

軟骨發(fā)育不全(Achondroplasis，ACH)是人類骨骼發(fā)育異常中常見的類型，又稱胎兒型軟骨營養(yǎng)障礙(Chondrodystrophia fetalis)，其基本病理變化是骨骺生長板區(qū)軟骨細(xì)胞的生長及成熟發(fā)生障礙，導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨障礙［1－3］。其基本的病理改變發(fā)生在軟骨化骨過程［4］，從胚胎內(nèi)開始骨化時(shí)即已出現(xiàn)，骨骺軟骨細(xì)胞可發(fā)生增殖，但不進(jìn)行正常的鈣化與骨化。臨床表現(xiàn)主要為個(gè)體矮小，頭大，前額圓凸;鼻梁下陷，上頜骨發(fā)育不良，隨年齡增長而更趨明顯。我國ACH的發(fā)生率為18/100萬，圍產(chǎn)期死亡率為1/10萬［5］，該病外顯率為100%，完善產(chǎn)前診斷技術(shù)將大大減少此類缺陷兒的出生。

1 遺傳概況

ACH的發(fā)病與遺傳有密切關(guān)系，為常染色體顯性遺傳。純合子患者的子女100%發(fā)病，雜合子患者的子女發(fā)病概率為50%。由于不少病人不結(jié)婚或難產(chǎn)，致使無下一代，因而影響到遺傳形式。有統(tǒng)計(jì)顯示80% －90%的病例沒有家族史，為散發(fā)性病例，實(shí)際上是一種基因突變的結(jié)果。臨床觀察表明，父親年齡大者生育軟骨發(fā)育不全患兒的機(jī)率明顯升高，故認(rèn)為其基因突變只發(fā)生在父系染色體，往往在受精之前即已發(fā)生，在精子發(fā)生過程中影響DNA復(fù)制和修復(fù)的因素，會(huì)增加基因突變的發(fā)生率［6］。但是，Tiemann等［7］專門研究了男性精子細(xì)胞的基因突變，發(fā)現(xiàn)與年齡并無明顯相關(guān)性。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，任何可能導(dǎo)致基因改變的外界因素都有可能導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全的發(fā)生，如接觸紫外線、X射線、致突變的化學(xué)物質(zhì)等。

2 ACH與FGFR3基因突變的關(guān)系

在不斷的研究過程中，人們對(duì)軟骨發(fā)育不全(ACH)有了逐步深刻的認(rèn)識(shí)。Shiang等［8］將ACH的致病基因定位于4號(hào)染色體短臂t末端，不久Rousseau等［9－10］幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)跨膜區(qū)基因第1138位核苷酸的突變是ACH發(fā)病的原因。FGFR3有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，其中第10外顯子編碼FGFR3跨膜區(qū)以DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的突變是第1138位核苷酸G—A堿基轉(zhuǎn)換，少數(shù)為G—C轉(zhuǎn)換，這兩種突變都導(dǎo)致了FGFR3跨膜區(qū)第380位密碼子的錯(cuò)義突變(甘氨酸 Gly 替換為精氨酸 Arg)［8－10］，是骨關(guān)節(jié)先天畸形中發(fā)生基因突變率最高的。FGFR3在骨骼發(fā)育初期的軟骨中表達(dá)水平最高，F(xiàn)GFR3與配體FGF結(jié)合后，引發(fā)耦聯(lián)和自磷酸化作用，通過干擾軟骨細(xì)胞的增生和分化抑制軟骨化骨過程。FGFR3跨膜區(qū)基因1138位核苷酸突變后［11－13］，引發(fā) FGFR3功能持續(xù)地、不依賴配體地激活，甚至在飽和濃度的配體中，突變的受體也拒絕配體介導(dǎo)的調(diào)控。這導(dǎo)致FGR3對(duì)骨骼生長的負(fù)向調(diào)節(jié)作用失控。近年另有學(xué)者分別在歐洲和日本ACH患者中發(fā)現(xiàn)了FGFR3基因1123位G—T顛換，導(dǎo)致375位密碼子的突變，即由半胱氨酸代替了甘氨酸，表明ACH與其他遺傳性疾病一樣存在著等位基因的異質(zhì)性。

3 產(chǎn)前影像學(xué)診斷

ACH的產(chǎn)前診斷常常是通過孕中、晚期的超聲檢查來診斷，B超下可見［14－15］胎兒頭大、短的股骨、脛骨和腓骨，三叉形態(tài)的和“古鐘”樣胸腔，胎兒腹部膨隆，腹圍增大，胎兒四肢短小，長管骨短粗且伴有彎曲，骨端膨大;羊水量增多。通過測(cè)定胎兒各長骨的長度、雙頂徑、頭圍、胸圍、腹圍、心/胸比值、足底長度等參數(shù)，觀察骨的長度、形態(tài)及骨化程度，可對(duì)約31%－39%的某些特定類型病例做出診斷。對(duì)于孕周確切的胎兒，長骨測(cè)量值低于預(yù)測(cè)值兩倍標(biāo)準(zhǔn)差以上時(shí)應(yīng)考慮胎兒有軟骨發(fā)育異常。超聲對(duì)先天畸形的檢測(cè)有較高的診斷價(jià)值，是初步篩查軟骨發(fā)育不全的理想方法，但僅能在孕中、晚期進(jìn)行診斷，故也有一定的局限性。

在實(shí)際工作中，當(dāng)胎兒骨骼畸形的形態(tài)改變?cè)诙S超聲中不十分典型或者相互雷同時(shí)，最好用三維超聲來確診，在三維超聲中，可見胎兒五官分布不協(xié)調(diào)，眼距稍寬，鼻梁稍塌，四肢短而彎曲，以近端長骨短為主，軀干長度正常，與四肢不成比例。三維超聲可以明顯地提高圖像的時(shí)間和空間分辨力，Krakow等［16］認(rèn)為三維超聲成像技術(shù)比普通的產(chǎn)科B超更容易發(fā)現(xiàn)異常。

宮內(nèi)三維螺旋CT、MRI可在先天性骨骼發(fā)育異常的產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)更多的異常征象，是對(duì)二維超聲檢查的有益補(bǔ)充。

4 產(chǎn)前基因診斷

4.1 胎兒DNA采集

4.1.1 母體血中富集胎兒DNA 長期以來，研究者一直試圖找到一種安全、可靠、對(duì)胎兒無任何損害的產(chǎn)前診斷方法。Saito等［17］用B超檢查1例妊娠婦女，懷疑其胎兒患有軟骨發(fā)育不全。為進(jìn)一步證實(shí)，將PCR技術(shù)與限制性片段多態(tài)性法相結(jié)合，擴(kuò)增并分析血漿中胎兒的成纖維細(xì)胞生長因子受體3基因片段，結(jié)果證實(shí)該片段上的1138位點(diǎn)上的G為A所取代。盡管胎兒細(xì)胞存在于母體外周血中已被許多學(xué)者所證實(shí)，但是由于其數(shù)量少、個(gè)體差異及不同妊娠周的含量不同，使其難以成為臨床實(shí)用的非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的檢測(cè)方法?，F(xiàn)在，利用母血漿中的胎兒DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷還在實(shí)驗(yàn)室階段。若要從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，尚需解決的問題有:首先必須改進(jìn)從血漿中提取胎兒DNA的方法以獲得高產(chǎn)量、高濃度的DNA模板;其次必須簡化檢測(cè)的環(huán)節(jié)，盡量早日實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以減少檢測(cè)操作過程中的污染。

4.1.2 超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮臍靜脈穿刺 超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù)獲取純胎兒血標(biāo)本，再從胎兒血中提取DNA，對(duì)快速胎兒染色體核型分析、基因異常、胎兒遺傳代謝缺陷等有診斷價(jià)值，是其他方法無法比擬的。但因其為入侵性的產(chǎn)前診斷方法，應(yīng)正確掌握指征，避免對(duì)母體及胎兒的損傷。提高手術(shù)的成功率及安全性，是普遍推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。為此必須高度重視超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù)的原則。

4.1.3 絨毛活檢術(shù) 絨毛活檢術(shù)(Chorionic villus sample，CVS)給胎兒的遺傳研究提供了可靠的研究材料。在孕早期細(xì)胞生長活躍時(shí)通過組織培養(yǎng)迅速獲得較羊水更多的細(xì)胞，從而可以更早期、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前診斷。標(biāo)本可直接用于細(xì)胞染色體核型分析或培養(yǎng)后進(jìn)行生化或基因圖譜［18］。Antoniadi等［19］用此方法對(duì)包括軟骨發(fā)育不全在內(nèi)的多種遺傳病進(jìn)行了基因診斷，并認(rèn)為如果操作規(guī)范這是避免來源母體DNA污染標(biāo)本較好的方法。但妊娠丟失率較高，始終是臨床頗感棘手的顧忌。

4.1.4 羊水細(xì)胞培養(yǎng) 目前，羊水細(xì)胞培養(yǎng)采用實(shí)時(shí)超聲監(jiān)測(cè)引導(dǎo)技術(shù)，使穿刺準(zhǔn)確性提高，并且穿刺針的管徑較小，可能降低胎兒流失率，是目前臨床常用的方法。然而，由于羊水中活細(xì)胞少，培養(yǎng)周期長，無菌要求高，稍不注意就會(huì)失敗，即使培養(yǎng)成功，因分裂相少，形態(tài)不佳，達(dá)不到分析要求，無法進(jìn)行進(jìn)一步研究，如熒光原位雜交技術(shù)(FISH)等［20］，使羊水產(chǎn)前診斷的應(yīng)用受到限制。

4.1.5 胚外體腔穿刺術(shù) 胚外體腔穿刺術(shù)是指孕早期在B超引導(dǎo)下，用穿刺針刺入孕囊內(nèi)的胚外體腔，抽取液體用作產(chǎn)前診斷的一項(xiàng)新技術(shù)［21－22］，是目前可以開展的較早的產(chǎn)前診斷取材技術(shù)。胚外體腔穿刺術(shù)不穿破羊膜，可避免羊水滲漏的發(fā)生及對(duì)胎兒的直接損害;不損傷絨毛，與絨毛活檢相比，可減少繼發(fā)胎兒畸形的發(fā)生率;胚外體腔細(xì)胞來自胚外的中胚層，較少遇到假嵌合體問題。據(jù)報(bào)道，胚外體腔液中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等［23－24］，抽取體腔液是否再生、體腔液的缺失是否對(duì)胎兒有遠(yuǎn)期影響，抽取體腔液的量與胎兒的近遠(yuǎn)期安全性的關(guān)系，仍需進(jìn)行大樣本、孕晚期、出生后的對(duì)照研究等。

4.2 基因診斷

4.2.1 PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single strand conformation polymorphism，SSCP)ACH 最常見的1138位G—A突變可被限制性內(nèi)切酶SfeI檢測(cè)出，抽提軟骨發(fā)育不全患者的DNA，PCR擴(kuò)增含有FGFR3基因高發(fā)突變位點(diǎn)G380R區(qū)域，將PCR產(chǎn)物直接用限制性內(nèi)切酶SfeI消化，15%PAGE凝膠電泳。電泳檢測(cè)結(jié)果是軟骨發(fā)育不全患者將出現(xiàn)正常PCR產(chǎn)物條帶及其被內(nèi)切酶消化后的兩條帶(109bp和55bp兩條DNA片段)，而患者父母及正常人僅出現(xiàn)PCR產(chǎn)物相同大小單條帶(l64bp的DNA片段)。PCR—限制性酶切法已成為檢測(cè)這一已知最常見點(diǎn)突變的有效方法。但是，SSCP的檢測(cè)條件可因DNA片段長度及核苷酸組成有較大差別，電泳條件可因突變類型不同而各異，故較難掌握;另外，可因加量不適當(dāng)導(dǎo)致多態(tài)性條帶，與正常條帶重疊不易判斷;另外還可由于變性不徹底而出現(xiàn)雙鏈，特別是異源雙鏈的干擾而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［25］。

4.2.2 基因測(cè)序 FGFR3是ACH的致病基因，該疾病的發(fā)生99%以上是由于FGFR3基因第1138位核苷酸的G－A堿基轉(zhuǎn)換或G－C堿基顛換(前一種突變占絕大多數(shù))引起，這兩種點(diǎn)突變均導(dǎo)致由該基因編碼的成熟蛋白質(zhì)的第380位的甘氨酸被精氨酸替代(G380R)［8－10］。對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以直接通過對(duì)PCR產(chǎn)物的基因測(cè)序來檢測(cè)FGFR3跨膜區(qū)基因的突變，將測(cè)序結(jié)果和正常基因序列對(duì)照，若能發(fā)現(xiàn)第1138位核苷酸發(fā)生G－A或G－C的堿基轉(zhuǎn)換則可確診為軟骨發(fā)育不全，若與正常序列相同則可完全排除。由于基因測(cè)序尚不能保證100%的準(zhǔn)確性，故應(yīng)取不同PCR產(chǎn)物從兩端分別進(jìn)行測(cè)序才能確診。

4.2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片(Gene chip，DNA chip，DNA microarray)將大量的核酸分子同時(shí)固定在載體上，一次可檢測(cè)分析大量的 DNA和RNA，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目標(biāo)分子數(shù)量少、成本高、效率低等的缺點(diǎn)［26］。Pinar等［27］研制出診斷軟骨發(fā)育不全的電化學(xué)芯片，并成功地用于軟骨發(fā)育不全的基因診斷。基因芯片診斷不但可以明確有無突變，而且能明確突變類型，高密度芯片診斷能達(dá)到與基因測(cè)序一樣的準(zhǔn)確性，并且能夠明確患者是雜合子還是純合子，產(chǎn)業(yè)化的芯片相對(duì)基因測(cè)序也更易于普及。目前，該技術(shù)在軟骨發(fā)育不全的基因診斷領(lǐng)域已顯示出重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

4.2.4 胚胎植入前診斷 植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)在胚胎植入子宮前進(jìn)行診斷，經(jīng)檢測(cè)胚胎無待測(cè)的遺傳缺陷時(shí)才被植入子宮。Rechitsky等［28］已經(jīng)成功地開展了軟骨發(fā)育不全的PGD。但是，因?yàn)檐浌前l(fā)育不全80%以上無家族史，僅對(duì)患者進(jìn)行PGD是不安全的，確保無任何遺傳病變嬰兒的出生，是產(chǎn)前診斷的最終目標(biāo)。對(duì)每例移植胚胎均在植入前進(jìn)行軟骨發(fā)育不全的突變篩選才是最安全的。

5 展望

軟骨發(fā)育不全畸形兒的出生給產(chǎn)婦及其家庭造成了巨大的心理和生理痛苦，為避免畸形兒出生，產(chǎn)前診斷已廣泛用于圍產(chǎn)期保健。提高先天性軟骨發(fā)育不全的產(chǎn)前診斷是廣大婦產(chǎn)科工作者的重要任務(wù)，也是提高我國優(yōu)生優(yōu)育水平的重要措施。我們建議將產(chǎn)前超聲檢查作為常規(guī)篩查，發(fā)現(xiàn)胎兒肢體短小時(shí)，應(yīng)行胎兒染色體檢查，排除染色體畸變，如21三體兒、18三體兒往往出現(xiàn)長骨短小。對(duì)于疑為先天性骨骼發(fā)育異常的胎兒，產(chǎn)前超聲檢查常難以確定其特定類型，對(duì)胎兒遺傳物質(zhì)的基因診斷是確診的最佳標(biāo)準(zhǔn)。而軟骨發(fā)育不全的胚胎植入前診斷將是軟骨發(fā)育不全夫婦生育健康后代的希望。

［1］ Muenke M，Schell U.Fibroblast－growth－factor receptor mutations in human skeletal disorders［J］.Trends Genet，1995，1(1)∶308－313.

［2］ Mulvihill JJ.Craniofacial syndromes:no such thing as a single gene disease［J］.Nat Genet，1995，9∶101 －103.

［3］ Rousseau F，Bonaventure J，Legeai－ Mallet L，et al.Mutations in the gene encoding fibroblastgrowth factor receptor－3 in achondroplasia［J］.Nature，1994，371∶252 －254.

［4］ Henderson JE，Naski MC，Aarts M，et al.A gain－of－function mutation of Fgfr2c demonstrates the roles of this receptor variant in osteogenesis［J］.Bone Miner Res，2007，15(1)∶155 －165.

［5］ 梁 娟，王艷萍，繆 蕾，等.中國圍產(chǎn)兒軟骨發(fā)育不全特征分析［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，9(16)∶1 523 －1 524.

［6］ Aitken R，Baker M，Sawyer.Oxidative stress in themale germ line and its role in the aetiology ofmale infertility and genetic disease［J］.Report Biomed Online，2003，7(1)∶65 －70.

［7］ Tiemann I，NavidiW，Grewal R，et al.The observed human sperm mutation frequency can not explain the achondroplasia paternal age effect［J］.Proc Nail Acad Sci USA，2007，99(23)∶14 952 － 14 957.

［8］ Shiang R，Thompson LM，Zhu YZ，etal.Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism ，achondroplasia［J］.Cell，1994，78(2)∶335 －342.

［9］ Rousseau F，Bonaventure J，Legeai－ Mallet L，et al.Mutations in the gene encoding fibroblastgrowth factor receptor－3 in achondroplasia［J］.Nature，1994，371(6 494)∶252 －254.

［10］ Vajo Z，F(xiàn)rancomano CA，W lkin DJ.Themolecular and genetic basis of fibroblastgrowth factor receptor3 disorders［J］.EndocrRev，2000，21(1)∶23 －39.

［11］ Monsonego－Organ E，Adar R，F(xiàn)eferman T，et al.The transmembranemutation G380R in fibroblast growth factor receptor 3 uncouples ligand－mediated receptor activation from down－regulation［J］.Mol Cell Biol，2007，20(2)∶516 －522.

［12］ Mlntosh I，Bellus GA，Jab EW.Fibroblast Growth Factor Receptor 3 Mutations in Achondroplasia and Related Forms of Dwarfism［J］.Cell Struct Funct，2007，25(2)∶85 － 96.

［13］ Wang Q，Green RP，Zhao G，et al.Differential regulation of endochondral bone growth and joint development by FGFR1 and FGFR3 tyrosine kinase domains［J］.Development，2008，128(19)∶3 867－3 876.

［14］ Berenice D，Romain F，Brigitte Viville，et al.Prenatal Sonographic diagnosis of skeletal dysplasias.A report of 47 cases［J］.Annales de Genetique，2007，43(3 －4)∶163 －169.

［15］ Lalini G，F(xiàn)eliee，Parrini S，et al.Polyhydranmio 6:a predictor of severe growth impairment in achondroplasia［J］.JPediator，2008，141(2)∶274 －275.

［16］ Krakow，Williams J，PoehlM，et al.Use of three－dimension－al ultrasound imaging in the diagnosis of prenatal－onset skeletal dysplasis［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2003，21(5)∶467 －472.

［17］ Saito H，Sekizawa A，Morimoto T，et al.Prenatal DNA diagnosis of a single gene disorder from maternal plasma［J］.Lancet，2007，356∶1 170.

［18］ Ahmed S.Transabdominal chorionic villus sampling(CVS)for prenatal diagnosis of genetic disorders［J］.J Coil Physicians Surg Pak，2006，16(3)∶204 －207.

［19］ Alfirevic Z，Sundberg K，Brigham S.Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis［J］.Cochrane Database Syst Rev，2003，3∶252 －256.

［20］ 胡章雪，李 力.先天性軟骨發(fā)育不全的產(chǎn)前診斷［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展雜志，2004，9(13)∶377 －379.

［21］ Lau TK，F(xiàn)ung TY，Wong YF，et al.A study of fetal sex determination in coclomic fluid［J］.Gynecol Obstel Invest，1998，45(1)∶16－18.

［22］ 游澤山，方 群.胚外體腔穿刺110例臨床研究［J］.新醫(yī)學(xué)，2001，34∶77 －79.

［23］ Burton GJ，Hempstock J，Jauniaux E.Nutrition of the luman fetus during the first trimester a review ［J］.Placenta，2001，22∶70 －77.

［24］ Jauniaux E，Gulbis B.Fluid compartments of the embryonic environment［J］.Hum Report Update，2006，6∶268 －278.

［25］ 方福德，周 呂，丁 菲，等.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧全書［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995∶1 100－1 108.

［26］ Wu J，Smith L，Plass TC.Chip － chip comesofage for genomewide functional analysis［J］.Cancer Res，2006，66(14)∶6 899.

［27］ Pinar K，Dilsat O，Arzum E，et al.Detection of achondroplasia G380R mutation from PCR amplicons by using inosine modified carbon electrodes based On electrochemical DNA chip technology［J］.Clinica Chimica Acta，2003，336(1)∶57 －64.

［28］ Rechitsky S，Verlinsky，Amet T，et al.Reliability of preimplantation diagnosis for single gene disorders［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，202，183(9)∶65 －68.

R681.1

A

1003—6350(2010)09—118—04

朱 泓(1979—)，女，上海市人，主治醫(yī)師，碩士。

2010－03－05)

·調(diào)查研究·