曹娜娜，黃紅蘭，趙春燕

·技術(shù)與方法·

電子基因芯片 DNA 等溫擴增技術(shù)檢測大腸埃希菌 O157∶H7 方法建立

曹娜娜，黃紅蘭，趙春燕

Nanogene 公司研制的電子基因芯片利用電子場、熱循環(huán)或化學技術(shù)等吸引帶負電的 DNA、RNA 或其他生物分子和探針結(jié)合到芯片特定位點上進行雜交檢測[1]。Nanogene電子芯片具有精確性和嚴謹性，對生物分子的電子吸引力大大加速了分子結(jié)合到芯片上的速度，與傳統(tǒng)的被動式芯片（如 Affymetrix、Genechip）相比，提高了 1000 倍以上。通常被動式芯片的點樣需要花幾個小時，而主動式電子芯片僅需要 30 ～ 60 s。

我們曾建立了一種等溫網(wǎng)狀分枝擴增技術(shù)（ramification amplification method，RAM），該方法利用環(huán)形探針和捕獲探針分離和檢測靶序列，當環(huán)形探針與靶基因結(jié)合時，在連接酶的作用下以共價鍵連接成環(huán)狀。然后，延著環(huán)形探針聚合酶延伸連接的正向引物，置換下游鏈，產(chǎn)生多聚 ssDNA，這個過程類似噬菌體體內(nèi)復制過程。再以多聚 ssDNA 作為模板，反向引物與它雜交、延伸、置換下游鏈，產(chǎn)生大的分枝復合物，導致指數(shù)級擴增，整個反應在等溫條件下進行[2]。RAM 具有和 PCR 一樣的靈敏度，而且等溫擴增不需要溫度循環(huán)儀，在任何條件下均可進行擴增反應。在本實驗中，我們將 RAM 方法與電子芯片有機結(jié)合起來，在電子芯片上進行 RAM 擴增，以大腸埃希菌的產(chǎn)志賀樣毒素 O157志賀毒素基因 2（shiga toxin 2，stx2）作為檢測靶基因，確定該方法的可行性，使電子芯片技術(shù)有更廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從臨床標本和食品中分離的 33 株菌株，其中 E.coli O157∶H7 23 株，E.coli O26∶H11 2 株，E.coli O111∶NM 1 株，痢疾志賀菌 3 株，血清型未確定的 4 株，分別由美國馬里蘭大學和中國疾病預防控制中心流行病所惠贈及本室分離鑒定保存；大腸埃希菌 ATCC23716 作為陰性對照菌株。

1.1.2 試劑 異硫氫酸胍、0.5% 牛血清白蛋白、0.5% 十二烷基鈉、組氨酸緩沖液、DMSO 均為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；Taq DNA 連接酶、Bst DNA 聚合酶為美國 New England Biolabs 公司產(chǎn)品；T4 Gene 32 蛋白為美國 United States Biochemical 公司產(chǎn)品；dNTP 為北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；EDTA 為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；Tris 為長春寶泰克生物科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Nanogen 電子芯片工作系統(tǒng) Nanogen 電子芯片工作系統(tǒng)包括三個部分：微電子芯片、上樣系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。微電子芯片是由 100 個或 400 個位點組成的半導體微電子芯片。上樣系統(tǒng)是通過電流將帶負電荷的 DNA 分子從96 孔板上樣到微電子芯片上。檢測系統(tǒng)是用于檢測熒光信號的強度，還可以通過提高反應溫度和低鹽溶液洗滌降低非特異性雜交和背景干擾。微電子芯片固定在一個卡套內(nèi)，表面的位點是由許多微電極構(gòu)建，微電極間由微電路連接，通過對微電極的電位控制，在微電極的上方完成探針分子的選擇性固著、靶核酸定向轉(zhuǎn)移集中并與探針主動雜交，未雜交或錯配雜交序列的去除等過程。

1.2.2 標本處理 將菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落放在離心管中，用生理鹽水洗 2 次，然后溶于 100 μl 5 mol/L 異硫氫酸胍（guanidium thiocyanate，GTC），0.5% 牛血清白蛋白，80 mmol/L EDTA，400 mmol/L HCl（pH 7.5），0.5% 十二烷基鈉，100 ℃ 煮沸 10 min，60 ℃ 過夜，將裂解的標本 –20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 環(huán)形探針、靶基因、引物和檢測探針與報告探針的設(shè)計 根據(jù)志賀樣毒素 2 基因（GenBank #X07865）設(shè)計環(huán)形探針和捕獲探針，環(huán)形探針兩端與靶基因互補區(qū)為25 個堿基，連接區(qū)大約為 70 個堿基。RAM 引物序列參考文獻[3-5]，具體序列見表 1。以上探針和引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.4 在電子芯片上 RAM 反應過程 將下面的各種反應液、洗液加到同一個 96 孔板的不同孔內(nèi)，進行如下反應：

表 1 環(huán)形探針、RAM 引物、合成靶基因及探針序列

將生物素標記的上游引物結(jié)合到芯片的不同位點上，電流為 0.6 μA，60 s，然后用 50 mmol/L 組氨酸洗滌芯片4 次；將 25 mmol/L 磷酸化環(huán)形探針和 1 μl 靶基因結(jié)合到已結(jié)合了引物的位點上，電流 0.995 μA，120 s，再用50 mmol/L 組氨酸洗芯片 4 次；將連接反應液結(jié)合到上述芯片位點上，反應液包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），25 mmol/L 乙酸鉀，10 mmol/L 乙酸鎂，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD，1 mmol/L TritonX-100，10 U Taq DNA 連接酶，電流 0.9 μA，120 s，然后將反應溫度提高到 60 ℃，反應 10 min；降低芯片溫度至室溫，用 0.5 mmol/L KiPO4（435 mmol/L K2HPO4和 65 mmol/L KH2PO4）洗滌芯片4 次；將 RAM 反應擴增液結(jié)合到上述芯片位點上，擴增液包括：300 μmol/L dNTP，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8），10 mmol/L KCl，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100，1.2 μmol/L 正向引物，1.2 μmol/L 反向引物，6.4 U Bst DNA聚合酶，4 ng T4Gene32 蛋白，6% DMSO。電流 0.9 A，120 s，反應溫度 60 ℃，反應 10 min。最后將檢測探針和報告探針分別結(jié)合到上述芯片位點進行檢測，電流 0.9 A，120 s。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的引物對芯片上 RAM 擴增的影響

為了確定引物最佳反應濃度，我們將不同濃度的生物素標記引物 500、250、125、62.5、31 nmol/L 結(jié)合到芯片不同位點上，且每個引物結(jié)合四個相同的位點，然后將磷酸化的環(huán)形探針和合成的靶基因結(jié)合上述位點上，每個位點的連接反應和擴增反應是一致的，結(jié)果見圖 1。從圖 1 可見，隨著引物濃度的增加，RAM 擴增效率也隨著增加，當引物濃度達到 125 nmol/L 和 250 nmol/L，RAM 擴增效率較高（F = 3.659，P ＜ 0.01），因此，在以后實驗中我們所用的引物濃度為 125 nmol/L。

2.2 電子芯片 RAM 擴增特異性分析

我們先將相同濃度（125 nmol/L）的生物素標記引物結(jié)合到芯片上，然后再分別將磷酸化環(huán)形探針與不同菌株的靶基因，包括產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O157∶H7，不產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O26∶H11、E. coli O111∶NM、痢疾志賀菌和E.coli ATCC23716 分別結(jié)合到已結(jié)合了引物的位點上，進行 RAM 擴增，結(jié)果見圖 2。從圖 2 可見，只有產(chǎn)志賀毒素 2 的 E.coli O157∶H7 擴增效率最高，而其他的菌株未被擴增，表明在芯片上 RAM 的擴增是對特異的靶基因擴增（F = 1.275，P ＜ 0.01）。

2.3 在電子芯片上進行 RAM 擴增檢測臨床標本和食品中分離的大腸埃希菌 O157：H7

我們利用電子芯片 RAM 擴增技術(shù)檢測了臨床標本和食品中分離的大腸埃希菌 O157∶H7 志賀毒素 2 基因，見圖 3。從圖 3 可見，在芯片位點可見到較強的熒光即為檢測志賀毒素 2 基因陽性的 O157∶H7。

圖 2 電子芯片 RAM 特異性檢測

圖 3 電子芯片 RAM 擴增檢測臨床標本和食品中分離的大腸埃希菌 O157∶H7

3 討論

近年來，DNA 基因芯片技術(shù)廣泛用于基因表達的檢測，而且這些 DNA 基因芯片檢測技術(shù)通常先進行基因擴增，然后再通過雜交檢測擴增產(chǎn)物。它們通常用于檢測一個生物基因組中的很多基因，普通的 DNA 芯片技術(shù)都是被動地將基因雜交到芯片上，而且一個樣本被雜交到整個芯片上，因些這種方法不能用于在同一個芯片上檢測多個病原體。電子 DNA 芯片技術(shù)能克服常規(guī)基因芯片的不足，它是將 DNA 主動地雜交到芯片指定位點上，這樣在電子芯片上可進行多重性分析，在同一個芯片上可同時檢測一個樣品的多個基因，或一個基因的多個樣品，或多個樣品的多個基因。目前 Nanogene 電子基因芯片技術(shù)已用于多種檢測如單鏈置換擴增分析[6]、單核苷酸多肽性分析（single nucleotide polymorphism，SNP）[7]、點基因突變、基因表達圖譜[8]、簡單串聯(lián)重復序列分析[9]、免疫學檢測以及病原生物檢測[10]。

在本實驗中，我們將 RAM 與電子 DNA 芯片技術(shù)結(jié)合起來，在電子 DNA 芯片上進行 RAM 擴增并檢測擴增產(chǎn)物，節(jié)約了反應時間。實驗結(jié)果表明，當生物標記的引物濃度為 125 mmol/L，RAM 擴增效率達到最高，熒光強度最強。而且我們將不同菌株靶基因結(jié)合到芯片上，結(jié)果表明，只有產(chǎn)志賀毒素 2 菌株靶基因的擴增效率最高，證實在電子芯片上 RAM 擴增是依賴于特異的靶基因，說明 RAM具有較高的特異性。而且我們又進一步在電子芯片上用RAM 檢測了臨床標本和食品中分離不同的 E.coli O157∶H7菌株，證實了此種方法的可行性，我們將該方法進一步完善，使之有更廣泛的臨床和科研應用前景。

參考文獻

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基金項目：吉林省衛(wèi)生廳項目（2008Z001）

作者單位：130021 長春，吉林大學白求恩醫(yī)學院病原生物系

通訊作者：趙春燕，Email：chunyanzhao44@yahoo.com

收稿日期：2010-09-21

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.012