馬雪梅, 白志剛, 張忠濤, 屈翔, 趙曉牧

紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥基因Txr1表達(dá)的影響

馬雪梅, 白志剛, 張忠濤, 屈翔, 趙曉牧

【摘要】

目的應(yīng)用人乳腺癌細(xì)胞制備紫杉醇耐藥細(xì)胞模型，探討紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞中紫杉醇耐藥基因 Txr1 表達(dá)的影響。

方法比較紫杉醇預(yù)處理前后不同濃度紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的改變；用 RT-PCR 方法檢測 Txr1、TSP1 和 MDR1 的 mRNA 水平變化；用 Western blot 檢測 Txr1 和 TSP1 的蛋白質(zhì)水平的變化。

結(jié)果紫杉醇預(yù)處理后，紫杉醇抑制乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 細(xì)胞）的生長作用明顯減弱。流式細(xì)胞儀分析表明，MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過紫杉醇作用后被阻滯于細(xì)胞周期的 G2M 期。紫杉醇作用于 MCF-7 細(xì)胞后，Txr1 的 mRNA 水平上調(diào)，TSP1下調(diào)，而 MDR1 表達(dá)無明顯改變。類似的結(jié)果在蛋白的水平被 Western blot 進(jìn)一步證實。

結(jié)論紫杉醇可能通過 Txr1 上調(diào)抑制 TSP1 的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤； 紫杉醇； 抗藥性，腫瘤； 凝血酶敏感蛋白 1

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(6):429-433

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，并且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。近年來，隨著乳腺癌診斷手段的不斷提高，治療方法的不斷完善，乳腺癌的死亡率呈現(xiàn)出下降的趨勢[1]。在臨床上乳腺癌的治療主要采用手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療相結(jié)合的綜合治療手段，并取得了顯著的治療效果，其中新型抗癌藥物的出現(xiàn)起到重要的作用[2]。紫杉類藥物是乳腺癌化療的主要藥物之一，但其存在的耐藥性是當(dāng)前亟需解決的問題。紫杉醇耐藥的機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的耐藥機(jī)制學(xué)說尚不能很好解釋其相關(guān)機(jī)制。新耐藥基因-紫杉醇耐藥基因（taxol-resistance gene 1，Txr1）的發(fā)現(xiàn)對研究紫杉醇耐藥機(jī)制提供了新的思路，但其在治療乳腺癌中的耐藥作用尚未見報道。我們擬應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7，制備出對紫杉醇耐藥細(xì)胞模型，研究 Txr1 的表達(dá)與MCF-7 細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇耐藥的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

紫杉醇購自協(xié)和藥廠；TRIzol、Lipofectamine 2000 購自美國 Invitrogen 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國 Pierce 公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、溴化丙錠（PI）購自美國 Sigma公司；MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國 Promega 公司；Txr1 兔抗人多克隆抗體由斯坦福大學(xué) Cohen 教授贈送；TSP1 兔抗人多克隆抗體（BA2130）、β-actin鼠抗人單克隆抗體購自美國 Sigma 公司；用含10% 的小牛血清（Gibco）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7（ATCC）購自美國 Gibco公司，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 耐藥細(xì)胞模型的建立 在 96 孔板中接種 MCF-7 細(xì)胞（2 × l04/孔），置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。細(xì)胞分為紫杉醇預(yù)處理組與對照組。紫杉醇預(yù)處理組分別加入不同濃度的紫杉醇（0.6、6 和 60 μg/ml），對照組加入稀釋成相應(yīng)濃度的紫杉醇，在培養(yǎng)第24、48、72、96、120 h，加入 MTT 20 μl（5 mg/ml），培養(yǎng) 4 h，再加入 DMSO 100 μl。溶解后用酶聯(lián)檢測儀（波長 A490 nm）測 OD 值，繪制細(xì)胞的生長曲線。紫杉醇預(yù)處理組細(xì)胞用 0.006 μg/ml 紫杉醇預(yù)培養(yǎng) MCF-7 細(xì)胞 7 d，然后以相同條件進(jìn)行上述實驗，比較紫杉醇預(yù)處理與未處理兩組細(xì)胞生長抑制的差異。

1.2.2 細(xì)胞周期的分析 收集對照組和紫杉醇預(yù)處理組細(xì)胞各 5 × 105個，70% 冷乙醇固定 4 ℃過夜，洗去固定液，緩沖液懸浮細(xì)胞。常溫下核糖核酸酶 A（RnaseA）（10 mg/ml）20 μl 反應(yīng) 1 h，再加入 PI（100 ng/ml）500 μl 避光染色 30 min，尼龍網(wǎng)（200 目）過濾，流式細(xì)胞儀檢測，Cellquest軟件分析細(xì)胞周期時相分布。

表 1 擴(kuò)增基因引物Table 1 Primer of gene amplification

1.2.3 RT-PCR 分析 MCF-7 細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA 表達(dá) RT-PCR 檢測 TXR1、TSP1、MDR1的 mRNA 表達(dá)，TXR1、TSP1、MDR1 和內(nèi)參β-actin 引物 Primer Premier 5.0 見表 1。收集狀態(tài)良好細(xì)胞，參照 TRIzol 試劑的說明抽提總量RNA，紫外分光光度計測定 RNA 濃度。逆轉(zhuǎn)錄為 20 μl 反應(yīng)體系，總 RNA 2.0 μg，Oligo（dT）（10 nmol/L）1 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，再加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水，混勻，70 ℃ 5 min，冰浴 5 min，再加入 5 × M-MLV 緩沖液 4 μl，核酸酶抑制劑（40 U/μl）0.5 μl，10 mol/L dNTP 1 μl，M-MLVRT（逆轉(zhuǎn)錄酶）1 μl，37 ℃ 反應(yīng) 60 min。PCR 反應(yīng)體系為 25 μl：cDNA，1 μl；2 × MasterMix，12.5 μl；primers，各 1 μl；無菌三蒸水，9.5 μl。反應(yīng)條件為 94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min；延伸 72 ℃，7 min，30 個循環(huán)。內(nèi)參為 β-actin，獨立實驗重復(fù) 3 次。電泳及半定量分析，擴(kuò)增產(chǎn)物在 2% 瓊脂糖凝膠中電泳（100 V，50 min），BIO-RAD Universal hood 成像系統(tǒng)分析各基因表達(dá)量，以各目的基因與 β-actin的灰度值之比作為相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 蛋白水平 TXR1，TSP1 收集對數(shù)期生長細(xì)胞，總蛋白經(jīng) RIPA 抽提后 BCA 法蛋白定量，按照上樣量為 50 μg 的量計算上樣體積，余下用 SDS 上樣緩沖液補足 20 μl，樣品經(jīng)β-2 巰基乙醇離心、加熱變性處理后上樣，電泳，5% 濃縮膠 60 V，12% ～ 15% 分離膠 120 V；電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，一抗（TXR1，1∶200；TSP1，1∶250；β-actin，1∶10000）4 ℃ 過夜，PBST 洗膜 3 次，HRP 標(biāo)記的二抗（1∶4000）30 min，PBST 洗膜 3 次，暗室中 ECL發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS13.0 統(tǒng)計分析軟件，分析各組間差異的顯著性。 限定 P ＜ 0.05 為差異有顯著性，所有服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均用±s表示，檢驗采用配對樣本 t 檢驗或獨立樣本 t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 分析紫杉醇預(yù)處理對紫杉醇抑制 MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

圖 1 紫杉醇預(yù)處理對紫杉醇抑制 MCF-7 細(xì)胞增殖的影響（A：對照組；B：紫杉醇預(yù)處理組）Figure 1 Taxol pretreatment on the effect of Taxol inhibited proliferation of MCF-7 cells (A: Control group; B: Taxol pretreatment group)

紫杉醇對 MCF-7 細(xì)胞增殖的影響：0.6、6 和60 μg/ml 的紫杉醇均能抑制 MCF-7 細(xì)胞的生長，藥物作用效果具有明顯的時效和量效關(guān)系（均 P ＜0.01），見圖 1A。然而，經(jīng)紫杉醇預(yù)處理后，紫杉醇對 MCF-7 細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減弱（圖 1B），與非預(yù)處理組相比兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 分析紫杉醇預(yù)處理對紫杉醇抑制 MCF-7 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測表明：MCF-7 細(xì)胞經(jīng)紫杉醇0.6、6 μg/ml 作用 24 h、48 h 后，G2M期細(xì)胞增多，G2M 期細(xì)胞和 S 期細(xì)胞的比值也隨劑量呈遞增關(guān)系；不同濃度的紫杉醇作用 MCF-7 細(xì)胞 48 h后，G2M 期細(xì)胞百分比均高于對照組（均 P ＜0.01），見表 2和圖 2。G0G1 期和 S 期細(xì)胞減少。提示 MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過紫杉醇作用后被阻滯于G2M 期。然而，經(jīng)紫杉醇預(yù)處理后，紫杉醇對MCF-7 細(xì)胞細(xì)胞周期的改變明顯減小，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 2 紫杉醇預(yù)處理對 MCF-7 細(xì)胞周期的影響Table 2 The effect of Taxol pretreatment on cell cycle of MCF-7

圖 2 紫杉醇預(yù)處理對 MCF-7 細(xì)胞周期的影響Figure 2 The effect of Taxol pretreatment on cell cycle of MCF-7

2.3 紫杉醇預(yù)處理對 MCF-7 中 TXR1 mRNA 的表達(dá)的影響

MCF-7 細(xì)胞表達(dá) TXR1、TSP1 和 MDR1。紫杉醇作用后，MCF-7 細(xì)胞 Txr1 mRNA上調(diào)，TSP1 mRNA 下調(diào)，而 MDR1 mRNA 表達(dá)無明顯改變（圖 3）。

圖 3 紫杉醇對 MCF-7 中 TXR1 mRNA 的表達(dá)水平的影響Figure 3 The effect of Taxol on the expression of TXR1 mRNA in MCF-7 cells

2.4 紫杉醇對 MCF-7 中 TXR1 的蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測結(jié)果 6 μg/ml、0.6 μg/ml 的紫杉醇作用于 MCF-7 細(xì)胞 24 h、48 h 后，TXR1的表達(dá)隨藥物濃度增加而增加，呈時間和劑量依賴性，見圖 4。

圖 4 紫杉醇對 MCF-7 中 TXR1 的蛋白表達(dá)水平的影響Figure 4 The effect of Taxol on the expression of TXR1 protein

3 討論

紫杉醇（Taxol，Paclitaxel）是一種抑制微管解聚的藥物，能促使微管蛋白迅速聚集成微管，并結(jié)合到微管上抑制微管的解聚，進(jìn)而影響微管聚合與解聚的動態(tài)平衡，阻礙紡錘絲的形成，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于 G2M 期，從而使細(xì)胞有絲分裂終止[3]。本實驗中，紫杉醇作用于乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 后，細(xì)胞增殖抑制，G2M 期細(xì)胞比例明顯增加，且作用具有明顯的時間和劑量依賴性。然而，MCF-7 細(xì)胞用紫杉醇預(yù)處理后，紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞 MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用明顯減弱，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，表明 MCF-7 細(xì)胞出現(xiàn)對紫杉醇的耐藥性。

臨床上紫杉醇對卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部惡性腫瘤等有顯著療效，單獨用藥對乳腺癌有效率可達(dá) 56%[4]。腫瘤耐藥是導(dǎo)致化療失敗的最主要原因，也是化療亟需解決的問題。紫杉醇應(yīng)用不久就發(fā)現(xiàn)有耐藥性。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干擾紫杉醇與微管結(jié)合的分子發(fā)生突變或多藥轉(zhuǎn)運蛋白 P2 糖蛋白表達(dá)上調(diào)時，將產(chǎn)生紫杉醇耐藥[5]。細(xì)胞凋亡途徑中一系列相關(guān)基因如 bcl-2、p53、erbB2 以及相關(guān)酶如 PKC、端粒酶等的活性改變，也可能與紫杉醇耐藥有關(guān)[6]。目前還在對紫杉醇以及其他抗癌藥耐藥機(jī)制進(jìn)一步深入研究[7]。

最近，Lih 等[8]發(fā)現(xiàn)紫杉醇耐藥基因（Txr1）可下調(diào)血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin-1，TSP1）的分泌，TSP1 具有促凋亡和抑制微血管形成作用，從而引起紫杉醇耐藥。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)：紫杉醇作用于乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 后，Txr1 的 mRNA和蛋白表達(dá)均隨時間延長而增加，而 TSP1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平隨時間下降。這一研究結(jié)果與 Lih 等的發(fā)現(xiàn)一致，提示紫杉醇耐藥基因的表達(dá)上調(diào)可能提高抑制 TSP1 誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥性。有學(xué)者檢測了術(shù)前未化療的非小細(xì)胞肺癌患者的新鮮腫瘤組織中 Txr1 和 TSP1 的 mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中具有高表達(dá) TSP1 和低表達(dá) Txr1的患者預(yù)后較好[9]。

由此我們分析，TSP1 可能是紫杉醇引起細(xì)胞凋亡作用的效應(yīng)基因，Txr1 上調(diào)引起的 TSP1減低可能是紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的新機(jī)制，是對紫杉醇耐藥機(jī)制的重要補充。但是 TSP1 與Txr1 間的具體作用機(jī)制還不清楚，進(jìn)一步深入研究將有益于全面了解紫杉醇耐藥的機(jī)制，從而進(jìn)一步提高紫杉醇的治療效果，改善乳腺癌患者的預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

[1] Marsh S, McLeod HL. Pharmacogenetics and oncology treatment for breast cancer. Expert Opin Pharmacother, 2007, 8(2):119-127.

[2] Moore A. Breast-cancer therapy--looking back to the future. New Engl J Med, 2007, 357(15):1547-1549.

[3] Horwitz SB. Mechanism of action of taxol. Trends Pharmacol Sci, 1992, 13(4):134-136.

[4] Sparano JA, Wang M, Martino S, et al. Weekly paclitaxel in the adjuvant treatment of breast cancer. N Engl J Med, 2008, 358(16): 1663-1671.

[5] Ferguson T, Wilcken N, Vagg R, et al. Taxanes for adjuvant treatment of early breast cancer. Cochrane Database Syst Rev, 2007(4): CD004421.

[6] Kutuk O, Letai A. Alteration of the mitochondrial apoptotic pathway is key to acquired paclitaxel resistance and can be reversed by ABT-737. Cancer Res, 2008, 68(19): 7985-7994.

[7] Hudis C, Dang C. The taxane limbo: how low can we go? J Natl Cancer Inst, 2008, 100(11):761-763.

[8] Lih CJ, Wei W, Cohen SN. Txr1: a transcriptional regulator of thrombospondin-1 that modulates cellular sensitivity to taxanes. Gene Dev, 2006, 20(15):2082-2095.

[9] Papadaki C, Mavroudis D, Trypaki M, et al. Tumoral expression of TXR1 and TSP1 predicts overall survival of patients with lung adenocarcinoma treated with first-line docetaxel-gemcitabine regimen. Clin Cancer Res, 2009, 15(11):3827-3833.

ObjectiveTo investigate the effect of Taxol resistance gene 1(Txr1) on Taxol-resistance in human breast cancer cell line in vitro.

MethodsHuman breast cancer cell line, MCF-7 was pre-treated with Taxol, and then cell proliferation and cell cycle of MCF-7 were respectively analyzed by MTT assay and flow cytometry in response to different concentration of Taxol. The expression of Txr1, TSP1 and MDR1 in mRNA and protein levels were detected by RT-PCR and western blot, respectively.

Results In response to Taxol, the inhibition of MCF-7 proliferation was reduced in Taxol pre-treated group as compared with the control group. The flow cytometry analysis indicated that MCF-7 cells were arrested at G2M phase. After Taxol pre-treatment, the expression of Txr1 mRNA are increase, expression of TSP1 mRNA was decrease, while expression of MDR1 mRNA was no significant change in MCF-7 as compared with the control. The similar changes of Txr1, TSP1 and MDR1 were also conformed in MCF-7 by western blot in protein level after Taxol pre-treatment.

ConclusionTaxol may induce taxol-resistance in cancer cells by inhibiting TSP1 expression via up-regulating of Txr1.

【Key words】Breast neoplasms; Taxol; Drug resistance, neoplasm; Thrombospondin 1

Author Affiliations:Department of General Surgery, Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 10050, China

Corresponding Author:ZHANG Zhong-tao, Email: zhangzht@yahoo.com.cn www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):429-433

作者單位：100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普通外科實驗室

通訊作者：張忠濤，Email：zhangzht@yahoo.com.cn

收稿日期：2010-02-22

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.006

Effect of Taxol resistance gene 1 on Taxol-resistance in human breast cancer cells

MA Xue-mei, BAI Zhi-gang, ZHANG Zhong-tao, QU Xiang, ZHAO Xiao-mu

【Abstract】