朱春暉，張德詠，劉勇

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所）

轉(zhuǎn)錄后基因沉默與植物抗病毒研究進(jìn)展

朱春暉1，張德詠2，劉勇2

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所）

主要綜述了轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）的發(fā)現(xiàn)、定義、機(jī)制、與植物抗病毒的關(guān)系及利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默防治植物病毒病研究進(jìn)展。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默；dsRNA；抗病毒

病毒病是農(nóng)作物的主要病害之一，素有植物“癌癥”之稱，難以防治，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年因植物病毒病所造成的產(chǎn)量損失約占糧食總產(chǎn)量的10%[1]。許多重要病毒已遍及我國農(nóng)作物的主要產(chǎn)區(qū)，對(duì)許多作物造成了不同程度的為害，嚴(yán)重影響著這些作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前生產(chǎn)上病毒病防治常用的方法有農(nóng)具、土壤消毒，使用農(nóng)藥驅(qū)除或殺死昆蟲介體，組織脫毒法獲得無病毒繁殖材料及用傳統(tǒng)育種方法引入抗性基因等[2]。這些方法都有不同程度的弊端，例如噴施農(nóng)藥不僅價(jià)格高，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染；組織脫毒法成本高、工作量大、有效期短；抗病育種存在資源貧乏，抗病基因和劣質(zhì)性狀基因連鎖、周期長(zhǎng)、抗性基因遺傳不穩(wěn)定以及不能解決某些品種間的遠(yuǎn)緣雜交等困難。從20世紀(jì)80年代初植物基因工程問世以來，科學(xué)家們就一直探索用基因工程的辦法來改良作物的抗病毒特性。將病毒基因組上基因的cDNA轉(zhuǎn)化到其他植物獲取抗病毒植株是當(dāng)前防治病毒病的重要途徑[3]。即應(yīng)用來源于病原的抗性 （pathogen-derived resistance），現(xiàn)在已經(jīng)有轉(zhuǎn)病毒的CP、MP等基因成功的例子[4]。但使用這種方法獲得高抗轉(zhuǎn)基因植物的幾率較小，因而尋找一種更高效、經(jīng)濟(jì)的獲取抗病毒轉(zhuǎn)基因植株的方法已是當(dāng)務(wù)之急，而植物RNA沉默機(jī)制的揭示為我們提供了新的防治植物病毒病害的前景[3]。

1 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 （post-transcriptional gene silencing，PTGS）的發(fā)現(xiàn)及定義

基因沉默（Gene silencing）[5]是指生物體中特定的基因由于種種原因不表達(dá)，主要發(fā)生在兩種水平上，一種是由于DNA甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)等引起的轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默 （transcriptional gene silencing，TGS），另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。PTGS是指轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核里能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的穩(wěn)定的mRNA存在的現(xiàn)象，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行特異性降解而使基因失活。基因沉默首先在轉(zhuǎn)苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）基因的矮牽牛（Petunia）中發(fā)現(xiàn)[6]，后來在其他生物中都有關(guān)于基因沉默的報(bào)道。不同領(lǐng)域的研究者給它作了不同的命名：植物學(xué)家稱之為共抑制（co-suppression）或轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）[7～8]；線蟲和果蠅的研究者稱之為RNA干擾（RNAi）[9]；真菌研究者稱之為消除作用（quelling）[10～11]。這些現(xiàn)象其實(shí)都是由同源的轉(zhuǎn)基因、RNA病毒和雙鏈RNA等誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特定序列的RNA降解機(jī)制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效地誘導(dǎo)該機(jī)制的起始[12]，隨后它被一種核酶（RNaseⅢ）切割成21~25 nt的小的干擾RNA（siRNA）[13],其中21~23 nt的siRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，共同作為引導(dǎo)物去選擇目標(biāo)RNA并對(duì)它進(jìn)行降解。植物中RNA沉默的最顯著特征是它是一種非細(xì)胞自發(fā)的過程，能夠局部誘導(dǎo)，隨后通過一種可移動(dòng)的信號(hào)分子擴(kuò)散至整個(gè)植物組織[9,14]。其作用表現(xiàn)在抵御病毒、轉(zhuǎn)座子等外來核酸的入侵、識(shí)別并抑制外源基因的表達(dá)，具有維持生物基因組穩(wěn)定性的重要功能[15]。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是由植物病毒載體感染植物引起的并啟動(dòng)相應(yīng)的寄主中RNA沉默的現(xiàn)象[16]。病毒誘導(dǎo)基因沉默能有效地抑制與內(nèi)源基因相關(guān)的一些生物合成途徑。病毒誘導(dǎo)基因沉默不僅是研究基因沉默機(jī)制的熱點(diǎn)，而且還是研究植物抗病防御和植物基因功能的一種有效手段。病毒誘導(dǎo)基因沉默是由RNA介導(dǎo)植物抗病防衛(wèi)機(jī)制（RNA-Mediated Defense，RMD）和一個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（PTGS）引起的。已經(jīng)證明，病毒誘導(dǎo)基因沉默是植物抗病的可能機(jī)制[17]。

2 PTGS的機(jī)制

PTGS是一個(gè)很復(fù)雜的過程，目前其機(jī)制還沒有統(tǒng)一[18]。從PTGS應(yīng)用的不同系統(tǒng)和不同的角度研究，人們先后提出了一系列的假說[19]。但其過程主要分為3步：起始、維持和傳導(dǎo)。目前對(duì)PTGS的誘發(fā)機(jī)制的解釋有3種模型，即RNA閾值模型、異常RNA模型、雙鏈RNA模型[20]。在這一系列模型中RNA起著非常重要的作用，它不僅是PTGS現(xiàn)象的啟動(dòng)因子，同時(shí)也是PTGS作用的靶分子[21]。不論何種誘發(fā)因素，所導(dǎo)致的RNA沉默最后都匯集到dsRNA產(chǎn)生后對(duì)同源性較高的目標(biāo)基因的mRNA降解這一過程上。

2.1 RNA閾值模型（RNA threshold model）

該模型認(rèn)為，由于激發(fā)了外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄，以至于積累到某個(gè)閾值，從而啟動(dòng)了降解特定mRNA的反應(yīng)，造成轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默[22]。

2.2 異常RNA模型（aberrant RNA model）

這一模型認(rèn)為轉(zhuǎn)基因mRNA的異常結(jié)構(gòu)激活了PTGS。Dougherty等[23]認(rèn)為在植物的細(xì)胞質(zhì)中存在一種依賴于RNA的RNA合成酶（RdRp），能以mRNA為模板合成小片段的cRNA，cRNA與mRNA雜交，從而成為專一性作用于雙鏈RNA的RNA降解酶的底物，提出了RdRp-cRNA模型。已從番茄中發(fā)現(xiàn)了RdRp，體外試驗(yàn)證明該酶能以RNA為模板合成cRNA[24]，在體內(nèi)這些cRNA雜合到相應(yīng)的mRNA上，被特異作用于雙鏈RNA的RNA降解酶降解。

2.3 雙鏈RNA模型

前面敘述的2種模型都著重于PTGS的起始，而隨著對(duì)參與PTGS的細(xì)胞成分及相關(guān)基因的深入研究，人們對(duì)PTGS作用機(jī)制有了更為詳盡的了解，現(xiàn)在普遍認(rèn)可的機(jī)制是在上述2種模型的基礎(chǔ)上由Waterhouse等[25]提出的dsRNA模型 。

①dsRNA對(duì)RNA沉默機(jī)制的啟動(dòng) 隨著PTGS的發(fā)現(xiàn)，許多理論都試圖去解釋RNA沉默的機(jī)制以及該機(jī)制的誘導(dǎo)因素[26～27]。現(xiàn)在普遍接受的觀點(diǎn)是dsRNA是RNA沉默的有效誘導(dǎo)因子，該機(jī)制通過降解特定序列的RNA發(fā)揮作用。通過使用以RNA病毒和轉(zhuǎn)基因?yàn)槟繕?biāo)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，該機(jī)制首次在植物中得到了證實(shí)。Waterhouse等[28]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)正義或反義的馬鈴薯Y病毒（PVY）蛋白酶（Pro）基因的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)PVY沒有抗性，但是同時(shí)表達(dá)正義和反義的PVY Pro基因的雜交煙草植株則對(duì)其產(chǎn)生免疫；與此相類似的是表達(dá)自我互補(bǔ)（hairpin）的GUS轉(zhuǎn)基因在沉默GUS基因方面，其效率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)轉(zhuǎn)正義或反義的GUS轉(zhuǎn)基因；煙草中79 nt的反向重復(fù)ACC氧化酶序列可以有效地抑制ACC氧化酶的表達(dá)[29]。這一結(jié)果進(jìn)一步證明，dsRNA是基因沉默的有效的誘導(dǎo)因子。在矮牽牛中也存在著CHS基因的沉默和相同基因的兩個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的反向重復(fù)插入的聯(lián)系[30]。這種轉(zhuǎn)基因的插入方式可以通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA[31]。不同情況下啟動(dòng)RNA沉默的dsRNA來源不同，轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNA沉默其dsRNA可以由轉(zhuǎn)基因的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，也可以將目標(biāo)基因的正義鏈和反義鏈同時(shí)轉(zhuǎn)入植物中雜交產(chǎn)生[28]，還可以通過RdRp將轉(zhuǎn)基因的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)變而成[32～33]；RNA病毒誘導(dǎo)的RNA沉默的dsRNA幾乎都來源于病毒復(fù)制的中間體[34]，少數(shù)像黃瓜花葉病毒（CMV），馬鈴薯X病毒（PVX）等病毒，它們復(fù)制中的dsRNA可以來自該病毒產(chǎn)生的異常RNA[35]；RNAi中的dsRNA則是來源于體外注射dsRNA等[9]。dsRNA在由單拷貝轉(zhuǎn)基因所引起的RNA沉默中的作用還未知，但是很可能某些轉(zhuǎn)基因，如CHS基因和Nii基因，當(dāng)它們的RNA足夠多時(shí)，在它們的編碼區(qū)含有能誘導(dǎo)沉默的dsRNA結(jié)構(gòu)[34]，另一種可能性是植物編碼的RdRp，把單鏈RNA作為模板去合成能誘導(dǎo)沉默的dsRNA[32～33]。至于DNA病毒，確實(shí)很難想象它的dsRNA是如何產(chǎn)生的。不過在它的基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時(shí)確實(shí)偶爾有dsRNA生成，現(xiàn)在人們推測(cè)DNA病毒誘導(dǎo)RNA沉默的原因有3種情況：一種是DNA病毒的復(fù)制能力和高轉(zhuǎn)錄水平能夠?qū)е耫sRNA分子的積累；另一種是dsRNA分子中以ssRNA為模板，通過寄主的RdRp合成的；第三種可能性就是在DNA病毒侵染的細(xì)胞中，誘導(dǎo)RNA沉默的因子本身就不是dsRNA分子。又有研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA在植物中能誘導(dǎo)特定序列的DNA甲基化[36～37]，從而促進(jìn)異常RNA產(chǎn)生，進(jìn)一步來強(qiáng)化PTGS。

②dsRNA降解成21~23 nt RNA Hamilton等[38]和Elbashir等[33]發(fā)現(xiàn)，有等量的正義鏈和反義鏈21~23 nt RNA存在于發(fā)生RNA沉默的植物和動(dòng)物中。這暗示著，誘導(dǎo)RNA沉默的dsRNA很可能是這些小分子的前體物質(zhì)。后來，Bernstein等[39]從果蠅（Drosophila）中分離到了一個(gè)RNase III的蛋白酶-Dicer，它能夠在體外把dsRNA降解成21~23 nt RNA[40]，21~23 nt RNA能夠特異性地攻擊目標(biāo)RNA。Dicer的缺失突變會(huì)減弱果蠅引發(fā)RNAi的能力，說明Dicer是催化切割dsRNA形成小分子RNA的一個(gè)關(guān)鍵酶，而Dicer的發(fā)現(xiàn)有力地支持了dsRNA確實(shí)是在Dicer的催化下降解成小分子RNA。

③21~23 nt RNA是RNA沉默的特異性決定因子在轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生RNA沉默時(shí)，發(fā)現(xiàn)有一種低分子量的反義RNA的持續(xù)積累，這種RNA與目標(biāo)mRNA序列具有高度同源性[38]。類似大小的RNA分子也在動(dòng)物執(zhí)行RNAi中檢測(cè)到[41～42]，它們是與一種核酸酶一起被分離的，并且這種核酸酶是一種由多個(gè)亞基組成的復(fù)合體，即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）[13]，低分子量的RNA是和RISC結(jié)合在一起的，它首先在果蠅S2細(xì)胞中被分離到。最近的研究表明，在果蠅中，21~23 nt RNA分子對(duì)于RISC誘導(dǎo)的同源、單鏈RNA分子的降解是必要的，并且也足夠誘導(dǎo)其發(fā)生降解[43]。低分子量的RNA在RISC復(fù)合物中能夠特異性地識(shí)別ss-RNA序列。這些都表明21~23 nt RNA可能是RNA沉默的特異性決定因子。

3 PTGS是植物自然的抗病毒機(jī)制

PTGS是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化的過程中形成的一種抵御外來病毒的防衛(wèi)機(jī)制。因?yàn)椋孩僭谵D(zhuǎn)病毒基因的轉(zhuǎn)基因植物中，病毒是RNA沉默降解的靶標(biāo)；②在轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)，病毒能誘導(dǎo)RNA沉默；③交叉保護(hù)試驗(yàn)中由于誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生的RNA沉默，而使植物對(duì)含有與之高度同源核酸序列的相近病毒的侵染具有抗病功能；④病毒表達(dá)特異的蛋白能抑制RNA沉默；⑤沉默信號(hào)的存在，也意味著RNA沉默是植物的抗病機(jī)制。在侵染細(xì)胞中產(chǎn)生的RNA沉默向侵染部位的前方傳導(dǎo)，因此，非侵染細(xì)胞接受信號(hào)后能激活自身的抗病反應(yīng)，使植物系統(tǒng)抗病。證明病毒誘導(dǎo)基因沉默與植物抗病有關(guān)的 3個(gè)經(jīng)典試驗(yàn)：①RNA病毒介導(dǎo) RMD （RNA Mediated Defence，RMD）。Ratcliff等人[45]利用線蟲傳花葉病毒屬中的番茄黑環(huán)病毒接種煙草（Nicotianasp.），該病毒攜帶與寄主植物基因序列相似的一段片段，可以誘導(dǎo)煙草后期出現(xiàn)同源依賴的抗病毒抗性。結(jié)果表明，抑制或預(yù)防病毒感染的植物體內(nèi)抗性機(jī)制是存在的[46]。②DNA病毒介導(dǎo)RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Al-Kaff等[47]人用花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）分別接種含有設(shè)計(jì)成與CaMV的DNA序列同源、部分同源或完全不同源3種的轉(zhuǎn)基因油菜，結(jié)果與病毒同源的轉(zhuǎn)基因在CaMV感染下被沉默。③基因沉默信號(hào)介導(dǎo)RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Hamilton等[48]人將帶有水母綠色熒光蛋白（Jellyfish Greenfluorescent Protein，GFP）的轉(zhuǎn)基因煙草 （Nicotiana benthamiana）浸泡在帶有GFP報(bào)告基因的農(nóng)桿菌菌液里，結(jié)果表明GFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是沉默的。進(jìn)一步試驗(yàn)證明，GFP轉(zhuǎn)基因沉默與GFP信使RNA水平降低有關(guān)。沉默是一種信號(hào)分子產(chǎn)生的，而且核酸是通過病毒或類病毒移動(dòng)的渠道在植物中移動(dòng)，阻止病毒擴(kuò)散。Bosher等[49]研究反義RNA是基因沉默的信號(hào)，因?yàn)橹灰凶銐虻乃拗骶幋a的RNA指導(dǎo)下的RNA聚合酶的底物，反義RNA（antisense RNA，asRNA）就能被合成，如果相關(guān)mRNA的3＇端特定部分降解，就會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。

4 利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）防治植物病毒病研究進(jìn)展

自從1986年Beachy等將TMV的外殼蛋白（CP）基因?qū)霟煵?，在世界上首次獲得了抗TMV感染的轉(zhuǎn)基因植株，隨后證明不但植物病毒的CP基因可在多種植物上產(chǎn)生不同程度的保護(hù)作用，病毒基因組上的其他基因，如復(fù)制酶（Rep）基因，移動(dòng)蛋白（MP）基因等轉(zhuǎn)化植物后也具有一定的抗性。目前，人們已將多種病毒來源的基因轉(zhuǎn)入多種植物獲得了多種抗病毒植株，有的已經(jīng)進(jìn)入了商品化生產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。然而，人們基本上還是將病毒基因組上某一基因的一段或全部基因的cDNA構(gòu)建成正義或反義結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入植物，所得抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的比例和抗性程度都不高。PTGS現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為植物病毒病的防治提供了新的可能。PTGS是真核生物細(xì)胞對(duì)外源遺傳因子的一種特異性的、高效率的降解機(jī)制，這種機(jī)制一旦被外源RNA分子所激活就能通過序列同源性的行為對(duì)任何胞質(zhì)RNA進(jìn)行降解[50]。自從首次在轉(zhuǎn)基因矮牽牛中發(fā)現(xiàn)RNA沉默現(xiàn)象以來，已發(fā)現(xiàn)RNA沉默是生物界中普遍存在的現(xiàn)象，是與植物的抗病性密切相關(guān)的過程[51]。RNA沉默的最突出的特征是它可以局部誘導(dǎo)，并通過韌皮部系統(tǒng)[52～53]傳播。盡管具體的沉默信號(hào)分子還未鑒定。但RNA降解過程的序列特定性表明，它很可能是一種核酸分子[35]。1998年Schiebel等[54]將PVY的Pro基因分別正向或反向轉(zhuǎn)入煙草中，再對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)雜交后代含有正向或反向Pro基因的轉(zhuǎn)基因煙草中，有約15%的植物對(duì)PVY產(chǎn)生抗性或免疫，而同時(shí)含有正向和反向Pro蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，對(duì)PVY有免疫作用的植株就占轉(zhuǎn)基因植株總數(shù)的44%~54%。他們推斷很可能在同一植物細(xì)胞中同時(shí)含有正義和反義RNA（即dsRNA）是誘導(dǎo)煙草植株對(duì)PVY免疫的真正原因。這是在植物界中，最早發(fā)現(xiàn)病毒抗性能同時(shí)被表達(dá)正義和反義RNA誘導(dǎo)。這一發(fā)現(xiàn)把研究基因功能、沉默植物的內(nèi)源基因以及抗病策略引向依靠同源的dsRNA誘導(dǎo)RNA沉默這一機(jī)制上。

隨著研究的深入，已有研究發(fā)現(xiàn)植物中的RNA沉默能被編碼dsRNA或自我互補(bǔ)的發(fā)夾RNA（hairpin RNA，hpRNA）所誘導(dǎo)[12，25，55]。人為設(shè)計(jì)這種類型的遺傳結(jié)構(gòu)，如將目標(biāo)基因的一段或全部cDNA設(shè)計(jì)成含有自我互補(bǔ)RNA的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)入植物以后能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生hpRNA，啟動(dòng)植物體內(nèi)的RNA沉默，從而降解hpRNA的雙鏈區(qū)和與雙鏈同源的內(nèi)源的mRNA。利用dsRNA能誘導(dǎo)RNA沉默從而導(dǎo)致與dsRNA同源的內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制已經(jīng)有幾例報(bào)道。2002年Stoutjesdijk等[56]報(bào)道了將擬南芥內(nèi)源的Delta脫氫酶基因（FAD2）構(gòu)建成hpRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥菜。發(fā)現(xiàn)大約有75%的轉(zhuǎn)hpRNA結(jié)構(gòu)的植物，Delta脫氫酶的活性急劇下降。Liu等也通過了hpRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)產(chǎn)生了富含硬脂肪酸和油酸的棉籽油。而在利用dsRNA技術(shù)進(jìn)行植物的抗病毒方面卻很少有報(bào)道。

2000 年Wang等[12]將大麥黃矮病毒-PAV（BYDVPAV）的聚合酶基因（Polymerase）構(gòu)建成hp BYDV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化大麥，有36%的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)BYDV-PAV具有免疫作用。2003年浙江大學(xué)的牛顏冰博士[57]以黃瓜花葉病毒（CMV）的Fny分離物的復(fù)制酶基因（△Rep）構(gòu)建成具有反向重復(fù)序列的pBluescript SK-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，有25/40的植株獲得對(duì)CMV的抗性；以番茄花葉病毒（ToMV）運(yùn)動(dòng)蛋白基因（MP）構(gòu)建成具有反向重復(fù)序列的pBluescript SK-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，有23/47的植株獲得了對(duì)TMV的抗性。而且研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)或摩擦接種的dsRNA都能啟動(dòng)RNA沉默的起始，但保持則需要與目標(biāo)RNA同源的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基因。2003年Anastasia[58]等用來源于PVY的CP基因構(gòu)建了能夠表達(dá)dsRNA的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化馬鈴薯，有12/15的轉(zhuǎn)基因的植株能夠產(chǎn)生抗性，而且對(duì)PVY的三個(gè)株系均有高度抗性。

從2003年開始，西班牙的Tenllado在這方面做了比較多的系統(tǒng)的研究。首先他及他的同事把辣椒輕度斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）的54 kDa蛋白區(qū)域、煙草蝕紋病毒（TEV）的HC-Pro蛋白、及苜?；ㄈ~病毒（AMV）的各個(gè)RNA的cDNA克隆體體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA，將得到的dsRNA與同源病毒摩擦接種植物葉片，發(fā)現(xiàn)只有與該病毒具有極高序列同源性的dsRNA才能對(duì)侵染產(chǎn)生干擾作用。其抗病性分析還表明，產(chǎn)生干擾侵染作用對(duì)dsRNA的長(zhǎng)度、濃度都有要求，而且植物中局部導(dǎo)入dsRNA不能誘發(fā)系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)[59]。隨后他們首次證實(shí)用含有能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA的結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌浸潤接種非轉(zhuǎn)基因植物葉片，所得dsRNA對(duì)植物病毒浸染具有干涉作用。并進(jìn)一步證明dsRNA對(duì)目的病毒有特異抗性，證實(shí)了誘導(dǎo)沉默的都是RNaseIII切割dsRNA的siRNAs[60]。他們還利用缺失RNAase III的大腸桿菌HT115（DE3）菌株[61]初步建立了dsRNA的細(xì)菌生產(chǎn)體系和粗提取方法，研究了dsRNA粗提取物處理植物的噴灑技術(shù)，為促使細(xì)菌生產(chǎn)dsRNA抗病毒技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用作了一些預(yù)期工作[62]。

2006 年Zhao等[63]人根據(jù)TMV 126 kDa蛋白基因設(shè)計(jì)合成shRNA（short hairpin RNA），能有效的干擾TMV的侵染，此干擾是序列特異的，受時(shí)間和位點(diǎn)影響，而且必須是shRNA與TMV接種在同一葉片上，此結(jié)果開啟對(duì)植物病毒在RNAi方面治療性的新進(jìn)展。

2008 年，張德詠等[64]構(gòu)建了含有CMV同源基因的RNA2片段和MP基因反向重復(fù)片段的原核表達(dá)載體。利用大腸桿菌HT115（DE3）菌株中可表達(dá)產(chǎn)生目的dsRNA。用能夠表達(dá)dsRNA的細(xì)菌超聲波破碎后在溫室中處理煙草進(jìn)行保護(hù)和治療試驗(yàn)，結(jié)果表明，兩種表達(dá)dsRNA的細(xì)菌破碎液能夠誘導(dǎo)煙草對(duì)CMV產(chǎn)生抗性，保護(hù)效果試驗(yàn)60 d后發(fā)病率分別為45%和60%，治療效果試驗(yàn)60 d后發(fā)病率分別為75%和85%，而其他對(duì)照發(fā)病率均為100%。此結(jié)果為dsRNA的田間應(yīng)用提供了研究參考。

[1]Fraser R.Plant resistance to viruses[M]//Encyclopedia of Virology (A Granoff and RG Webster,eds.)Academic Press, San Diego,California,1999:1 300-1 307.

[2]程海鵬，朱睦元，金偉，等.植物轉(zhuǎn)基因沉默研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，2001，21（6）：42-47.

[3]孟祥兵，王秀芳.基因沉默[J].生命的化學(xué)，2001，21（6）：111-114.

[4]Rob G,Etienne B,Marcel P.Resistance mechanisms to plant viruses:an overview[J].Virus Res,2003,92：207-212.

[5]郭興啟，朱常香，宋云枝.RNA沉默與植物病毒[J].生命科學(xué)，2002，14（1）：9-13.

[6]Napoli C,Lemieux C,Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous gene in trans[J]. Plant Cell,1990,2:279-289.

[7]Baulcombe D.Unwinding RNA silencing [J].Science, 2000,290:1 108-1 109.

[8]Matzke M,Matzke A,Pruss G,et al.RNA-based silencing strategies in plants[J].Cur Opin Genet Dev,2001,11:221-227.

[9]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391：806-811.

[10]Romano N,Macino G.Quelling:transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences[J].Mol Biol，1992,6:3 343-3 353.

[11]Cogoni C,Irelan J T,Schumacher M,et al.Transgene silencing of the al1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation[J].EMBO, 1996,15:3 153-3 163.

[12]Wang M B,David C A.Waterhouse P M.A single copy a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to Barley yellow dwart virus[J].Mol Plant Pathol, 2000,1：347-356.

[13]Hammond S M,Bernstein E,Beach D,et al.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404:293-296.

[14]Winston W M,Molodowitch C,Hunter C P.Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1[J].Science,2002,295:2456-2459.

[15]Ratcliff F G,Martin-Hernandez A M,Baulcombe D C.Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing[J].Plant J,2001,25：237-245.

[16]周曉馥，王興智.病毒誘導(dǎo)基因沉默-植物抗病的可能機(jī)制[J].松遼學(xué)刊：自然科學(xué)版，2001（3）：5-16.

[17]劉征，李潤植.轉(zhuǎn)錄后基因沉默與植物抗病毒防衛(wèi)機(jī)制[J].植物生理學(xué)通訊，2001（37）：274-279.

[18]Kooter J M,Matxke M A,Meyer P.Listening to the silent gene：transgene silencing，gene regulation and pathogen control[J].Trends Plant Sci，1999，4：340-347.

[19]Agustin C,Giuseppe M.Characteristics of post-transcriptional gene silencing[J].EMBO,2001,2：992-996.

[20]段發(fā)平，梁承鄴.轉(zhuǎn)錄后水平沉默與基因表達(dá)[J].生物學(xué)通報(bào)，2002（37）：15-16.

[21]Vaucheret H,Christophe B,Mathilde F.Post-trascritional gene silencing in plants[J].J Cell Sci，2001,114：3 083-3 091.

[22]Waterhouse P M,Grahrn M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95：13 959-13 964.

[23]Baulcombe D C,English J.Ectopic pairing of homologous DNA and post-transcriptional silencing in transgenic plants[J].Curr Opin Biotechnol,1996,7：173-180.

[24]劉楊，蔣彥，喬代蓉，等.轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制及其應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，18：140-143.

[25]Marx J.Interfering with gene expression [J].Science, 2000,288：1 370-1 372.

[26]Waterhouse P M,Smith N A,Wang M B.Virus resistance and gene silencing:killing the messenger[J].Trends Plant Sci,1999,4:452-457.

[27]Hamilton A J,Brown S,Han Y,et al.A transgene with Repeated DNA causes high frequency,post-transcriptional suppression of ACC-oxidase gene expression in tomato[J]. Plant J,1998,15:737-746.

[28]Meins F.RNA degradation and models for post-transcriptional gene silencing[J].Plant Mol Biol,2000,43:261-273.

[29]Stam M,Bruin R,Kenter S,et al.Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene Repeats[J].Plant J,1997,12:63-82.

[30]Dalmay T,Hamilton A,Rudd S,et al.An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus[J].Cell,2000,101:543-553.

[31]Ding S W.RNA silencing[J].Curr Opin Biotechnol, 2000,11：152-156.

[32].Mourrain P,Biclin C,Elmayan T,et al.Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for post-transcriptional gene silencing and natural virus resistance[J].Cell,2000,101: 533-542.

[33]Cogoni C,Macino G.Post-transcriptional gene silencing across kingdoms[J].Curr Opin Gen Dev,2000,10:638-643. [34]Voinnet O.RNA silencing as a plant immune system against virus[J].Trends Genet，2001，17:449-459.

[35]Mette M F,Aufsatz W,Winden J,et al.Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA[J].EMBO,2000,19:5 194-5 201.

[36]Sijen T,Vijn I,Rebocho A,et al.Transcriptional and post-transcriptional gene silencing are mechanistically related[J].Curr Biol,2001,11:436-440.

[37]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants [J].Science,1999,286:950-952.

[38]Elbashir S M,Lendeckel W,Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-22-nucleotide RNAs[J].Genes Dev, 2001,15:188-200.

[39]Bernstein E,Caudy A A,Hammond S M,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409:363-366.

[40]Parrish S,Fleenor J,Xu S,et al.Functional Anatomy of a dsRNA Trigger Differential Requirement for the Two Trig-ger Strands in RNA Interference[J].Mol Cell,2000,6: 1 077-1 087.

[41]Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,et al.RNAiDouble-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals[J].Cell,2000,101: 25-33.

[42]Elbashir S M,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411:494-498.

[43]Thomas C L,Jones L,Baulcombe D C,et al.Size constraints for targeting post-transcriptional gene silencing and for RNA-directed methylation in Nicotiana benthamiana usinga potato virus X vector[J].Plant,2001,25:417-425.

[44]Covey S N,Al-kaff N S,Langara A,et al.Plants combat infection by gene silencing[J].Nature,1997,385:781-782.

[45]Ratcliff F G,MacFarlane S A,Baulcombe D C.Gene silencing without DNA:RNA-mediated cross protection between viruses[J].Plant Cell,1999,11:1207-1215.

[46]Roossinck M J.Cucumber mosai virus，a model for RNA virus evolution[J].Mol Plant Pathol,2001,2：59-63.

[47]Voinnet O,Baulcombe D C.Systemic signalling in gene silencing[J].Nature,1997,389：553.

[48]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional silencing in plant[J]. Science,1999,286：950-952.

[49]Bosher J M,Labouesse M．RNA interference genetic wand and genetic watchdog[J].Nat Cell Biol，2000,2：E31-E36.

[50]Bestor T H.Gene silencing as a threat to the success of gene threapy[J].J Clin Invest，2000,105：409-411.

[51]Palauqui J C,Elmayan T,Pollien J M,et al.Systemic acquired silencing:transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions[J].EMBO,1997,16:4 738-4 745.

[52]Voinnet O,Lederer C,Baulcombe D C.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana[J].Cell,2000,103:157-167.

[53]Smith N A,Singh S P,Wang M B,et al.Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407:319-320.

[54]Schiebel W.RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves Catalytic in vitro properties[J].J Biol Chem, 1993,268：11 858-11 867.

[55]Tavernarakis N,Wang S L,Dorovkov M,et al.Heritable and inducible genetic inter-ference by dsRNA[J].Nat Genet,2000,24：180-183.

[56]Stoutjesdijk P A,Singh S P,Liu Q,et al.hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing[J].Plant Physiol,2003,129: 1 723-1 731.

[57]牛顏冰，郭失迷，宋艷波，等.RNA沉默-新型的植物病毒病害防治策略[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005（13）：47-51.

[58]Anastasia M,Kriton K,Alexandra B,et al.Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y（PVY）through RNA silencing[J].Mol Breeding,2004,14：185-197.

[59]Tenllado F,Cesar L,JoseRamon D R.RNA interference as new biotechnological tool for the control of virus disease in plants[J].Virus Res,2004：85-96.

[60]Tenllado F,Barajas D,Vargas M,et al.Transient Expression of homologous hairpin RNA causes interference with plant virus infection and is overcome by a virus encoded suppressor of gene silencing[J].MPMI,2003,16：149-158.

[61]Timmons L,Donald L C,Andrew F.Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans[J].Gene, 2001,263：103-112.

[62]Tenllado F,Belen M G,Marisol V,et al.Crude extgracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections[J].BMC Biotechnology, 2003,3：3-13.

[63]Zhao M M,An D R,Zhao J,et al.Transiently expressed short hairpin RNA targeting 126kDa protein of tobacco mosaic virus interferes with virus infection [J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2006,38：22-28.

[64]張德詠，朱春暉，成飛雪，等.表達(dá)dsRNA的細(xì)菌提取液可抑制黃瓜花葉病毒對(duì)煙草的侵染[J].植物病理學(xué)報(bào)，2008（6）：304-311.

Progress on Post-transcriptional Gene Silencing and Anti-virus of Plant

ZHU Chunhui1,ZHANG Deyong2,LIU Yong2
(1.Department of Longping,Zhongnan University,Changsha 410125;2.Hunan Institute of Plant Protection)

The discovery,definition,mechanism,the relation with plant anti-virus of post-transcriptional gene silencing (PTGS),and controlling plant virus through PTGS are summarized.

Post-transcriptional gene silencing;Double-stranded RNA;Anti-virus

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.08.001

朱春暉（1980-），女，在職博士，助理研究員，研究方向是植物病毒分子生物學(xué)，電話：0731-84411303，13782032139。E-mail：zhuchunhuizhb@yahoo.com.cn

2009-10-09