李 琳,邵洪澤,任科研,毛文智,許志林,姚新華

(吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,吉林長(zhǎng)春 130062)

小鵝瘟馬源高免血清的制備及應(yīng)用*

李 琳,邵洪澤,任科研,毛文智,許志林,姚新華*

(吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,吉林長(zhǎng)春 130062)

采用JLDA株小鵝瘟抗原,高免馬匹后經(jīng)采血精制可獲得滴度為1∶64～1∶128的抗小鵝瘟高免血漿。通過胃蛋白酶消化-硫酸銨鹽析的工藝,得到小鵝瘟馬源高免血清。按0.5 mL/羽劑量共預(yù)防雛鵝52.48萬羽,按1 mL/羽～3 mL/羽劑量共治療感染雛鵝5.66萬羽,證實(shí)該抗血清效價(jià)高,對(duì)雛鵝的預(yù)防保護(hù)率為95.58%,對(duì)感染雛鵝的治愈率為92.87%,表明對(duì)小鵝瘟防治安全高效。馬采血量大,成本低,同時(shí)有效地避免了同源動(dòng)物間其他疫病的感染和強(qiáng)毒的散播,較之用鵝作為血清來源動(dòng)物經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。

小鵝瘟;鵝細(xì)小病毒;馬源高免血清;制備;應(yīng)用

*通訊作者

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus virus,GPV)引起的雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病,主要發(fā)生于1月齡內(nèi)雛鵝和雛番鴨,以滲出性腸炎、小腸黏膜表層大片壞死脫落、腸道栓塞為特征性病變的一種烈性傳染病。該病病程短、傳染性強(qiáng)、病死率高,10日齡內(nèi)雛鵝發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%,在易感群中的致死率高達(dá)70%。近幾年,隨著吉林省養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展和品種交換,以及高密度飼養(yǎng)增加,小鵝瘟這種烈性傳染病廣泛的發(fā)生及流行,對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的威脅。小鵝瘟的防制主要依賴于弱毒疫苗或滅活疫苗的免疫接種[1],鵝群一旦感染后,各種藥物治療除了防止繼發(fā)感染外,對(duì)改善病情無任何作用,惟一有效的治療辦法就是給感染鵝注射抗血清[2]。本研究研制出了小鵝瘟精制馬源高免血清,取得了理想的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫用馬 購(gòu)自非疫區(qū),經(jīng)檢查未見任何疫病的 3歲～8歲營(yíng)養(yǎng)良好,健康馬12匹,體重約250 kg～300 kg。購(gòu)進(jìn)后隔離飼養(yǎng),驅(qū)蟲,檢疫。在隔離期間進(jìn)行馬傳貧瓊擴(kuò)試驗(yàn)[3]和鼻疽菌素點(diǎn)眼試驗(yàn),均為陰性者方可用于制造本品。

1.1.2 試驗(yàn)用雛鵝 1日齡雛鵝,購(gòu)自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院,不含小鵝瘟母源抗體,也未接種小鵝瘟疫苗的健康雛鵝。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原

1.2.1.1 水劑抗原 采用JLDA株,接種11日齡鴨胚,37.5℃條件下孵育,收集72 h～144 h之間死亡鴨胚胚液(羊水+尿囊液)。經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)為陰性,滴度在10-5ELD50/0.2 mL以上者,作為免疫用水劑抗原,置冰箱內(nèi)冷凍保存[4-6]。

1.2.1.2 油乳劑抗原 將濃縮的水劑抗原,經(jīng)40 mL/L甲醛滅活后與油乳劑(97 mL白油,3 mL司班-80,2 g硬脂酸鋁,加熱溶解后 120℃高壓30 min后使用)按1∶1比例,進(jìn)行高速攪拌制成油乳劑滅活抗原[7]。

1.2.2 免疫程序

1.2.2.1 基礎(chǔ)免疫 經(jīng)檢驗(yàn)合格的馬匹,即可進(jìn)行基礎(chǔ)免疫;注射抗原3次,分別間隔10 d注射油乳劑滅活抗原25 mL/匹,注射部位以頸、肩部及身驅(qū)兩側(cè)為主,輪換注射,每個(gè)注射點(diǎn)的每次注射劑量不宜過多。

1.2.2.2 強(qiáng)化免疫 用濃縮的水劑抗原按25 mL/匹,皮下或肌肉注射,免疫后第15天采血,用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)測(cè)定效價(jià)。

1.2.3 血清抗體效價(jià)檢測(cè) 采用瓊脂免疫雙擴(kuò)法,制備10 g/L生理鹽水瓊脂板,瓊脂板上打梅花形孔,孔徑為5 mm,孔距為3 mm,中間孔滴加小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原,周圍孔分別加被檢血清,同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對(duì)照,放入濕盒內(nèi),37℃放置24 h～48 h觀察結(jié)果[8-9]。

1.2.4 采血 當(dāng)免疫馬的小鵝瘟抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后,開始從頸靜脈采血。局部徹底消毒,在無菌的條件下采血,采血量按17 mL/kg～19 mL/kg計(jì)算。10 000 r/min離心 10 min,抽取上清,同時(shí)加入50 mg氯仿或30 mg硫柳汞,加塞密封充分搖勻,每瓶血清應(yīng)作詳細(xì)記載[10]。

1.2.5 抗小鵝瘟血清的精制 將要精制的血清混合于同一容器內(nèi),按血清量的2倍加入蒸餾水,充分?jǐn)嚢杈鶆?用2 mol/L NaOH調(diào)整pH為3.5±0.1,然后按6 IU/mL～9 IU/mL加入胃蛋白酶和2 g/L甲苯,在29℃～31℃中消化2 h～24 h,消化期間要經(jīng)常攪拌。消化完畢的溶液按150 g/L加入硫酸銨,溶解后用2 mol/L NaOH調(diào)整pH為4.6±0.1,然后用水浴方法加溫,使之達(dá)到57℃±1℃保持30 min,待溶液冷卻至43℃以下時(shí),用帆布濾過,沉淀廢棄。收集的上清液盛于同一容器內(nèi),用2 mol/L NaOH 調(diào)整pH為 7.2±0.1后,加入1.2 mol/L的硫酸銨,充分?jǐn)嚢枋怪芙?然后用帆布濾過,清液廢棄。收集沉淀稱重,按量加入5倍～6倍蒸餾水,溶解后,按總量加入100 g/L的明礬溶液使明礬含量為10 g/L,用2 mol/L NaOH調(diào)整pH為7.7～7.8,靜置2 h～4 h使之沉淀。然后用帆布濾過,沉淀經(jīng)水洗壓干后廢棄。將透明清液混合于同一容器中,按量加入1.2 mol/L硫酸銨,經(jīng)攪拌溶解后用帆布過濾,上清廢棄,沉淀壓干后用透析袋分袋包裝。每包約200 g～250 g加少許氯仿,放置在流水槽進(jìn)行透析48 h～72 h。收集袋內(nèi)血清,按量加入5 g/L氯仿、9 g/L氯化鈉和30 mg硫柳汞,充分搖勻,溶解后用蔡氏澄清濾板濾過一次,濾液即為抗小鵝瘟血清。然后于5℃～15℃靜置沉淀?？寡逶陟o置時(shí)期,每批抽取樣品作效價(jià)測(cè)定、無菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn),合格者進(jìn)行分裝[11]。

1.2.6 抗血清的檢驗(yàn)

1.2.6.1 無菌檢驗(yàn) 按生物制品無菌檢驗(yàn)常規(guī)法進(jìn)行,取1 mL抗血清,接種于馬丁肉湯和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.6.2 安全檢驗(yàn) 抗血清批次分別是090123,090212,090316,經(jīng)檢驗(yàn)抗體效價(jià)為1∶32～1∶64。1日齡易感鵝雛40只,生長(zhǎng)發(fā)育良好,無小鵝瘟相應(yīng)抗體,適應(yīng)觀察2日進(jìn)行試驗(yàn),在接種前核實(shí)鵝的全身狀況和臨床疾病情況。所有的鵝均健康,沒有任何鵝被排除在本試驗(yàn)外。隨機(jī)均分為4組,即3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,試驗(yàn)組分別用 090123,090212,090316批次的抗血清接種,接種劑量為0.5 mL/只,皮下或肌肉注射。觀察20 d,內(nèi)容包括精神狀態(tài)、飲食欲、體溫等,記錄試驗(yàn)結(jié)果[12]。

1.2.6.3 抗血清對(duì)雛鵝的保護(hù)試驗(yàn) 強(qiáng)毒抗血清混合液:取0.1 mL小鵝瘟強(qiáng)毒液,加入0.9 mL的抗血清,置37℃水浴箱內(nèi)感作2 h,即得所需。

強(qiáng)毒稀釋液:取0.1 mL小鵝瘟強(qiáng)毒液,加入0.9 mL的無菌生理鹽水,即得所需。

3日齡試驗(yàn)用鵝雛60只,隨機(jī)均分6組,每批次抗血清2組,每組10只。第1組為試驗(yàn)組,第2組為對(duì)照。試驗(yàn)組用0.5 mL/只劑量接種強(qiáng)毒抗血清混合液1次,皮下注射;對(duì)照組用0.2 mL/只劑量接種強(qiáng)毒稀釋液,皮下注射1次。觀察飼養(yǎng)15 d,記錄結(jié)果。

1.2.6.4 保存期測(cè)定 將制備的抗血清隨機(jī)選取三個(gè)批次,每一批次的血清均保留3份,放置于4℃～8 ℃環(huán)境中保存,保存3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月。保存前后分別測(cè)其抗體效價(jià),檢測(cè)方法選用AGP法。

1.2.6.5 臨床最佳預(yù)防劑量測(cè)定 將試驗(yàn)雛鵝160只隨機(jī)均分4組,每組 40只。第 1組、第 2組、第3組均為試驗(yàn)組,第4組為對(duì)照。試驗(yàn)1組預(yù)防劑量用0.25 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗(yàn)2組預(yù)防劑量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗(yàn)3組預(yù)防劑量用1 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;對(duì)照組不接種抗血清。5 d后分別使用JLDA株強(qiáng)毒攻擊,攻毒后觀察飼養(yǎng)20 d,記錄結(jié)果。

1.2.6.6 被動(dòng)免疫保護(hù)期的測(cè)定試驗(yàn) 3日齡試驗(yàn)用鵝雛180只,臨床檢查健康,用0.5 mL/只劑量抗血清接種120只3日齡試驗(yàn)雛,之后隨機(jī)均分6個(gè)試驗(yàn)組,每組20只。試驗(yàn)組分別于接種抗血清后第 3 天、第 5 天 、第 7 天、第 10 天 、第 12 天、第 15 天等時(shí)間用JLDA株強(qiáng)毒攻擊;對(duì)照組60只不接種抗血清,在各試驗(yàn)組攻毒時(shí)同時(shí)攻毒,每次5只。攻毒后隔離觀察飼養(yǎng)15 d,記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6.7 臨床最佳治療劑量測(cè)定試驗(yàn) 用JLDA株強(qiáng)毒10-6ELD50/0.2 mL接種130只3日齡試驗(yàn)鵝,之后隨機(jī)均分4個(gè)試驗(yàn)組,前3組為試驗(yàn)組。每組40只,于第3天發(fā)病時(shí)開始應(yīng)用抗血清。試驗(yàn)1組治療劑量用0.5 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗(yàn)2組治療劑量用1.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;試驗(yàn)3組治療劑量用2.0 mL/只抗血清皮下或肌肉注射1次;對(duì)照組10只不接種抗血清。記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6.8 區(qū)域應(yīng)用試驗(yàn) 將生產(chǎn)的3批次抗血清產(chǎn)品,批號(hào)為090123,090212,090316。用于預(yù)防雛雞最終效價(jià)稀釋為32×,治療雛雞最終效價(jià)稀釋為64×并按規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)合格,應(yīng)用于長(zhǎng)春、白城、松原、吉林、四平、遼源等地養(yǎng)鵝戶雛鵝。預(yù)防雛鵝524 800只,治療感染小鵝瘟發(fā)病雛鵝56 600只。對(duì)部分預(yù)防和治療雛鵝跟蹤隨訪,統(tǒng)計(jì)防治效果。

2 結(jié)果

2.1 抗血清檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 無菌檢驗(yàn)結(jié)果 制備的高免血清在馬丁肉湯和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h,觀察未見細(xì)菌生長(zhǎng)。肉湯清亮,鏡檢無菌。

2.1.2 安全檢驗(yàn)結(jié)果 各組的試驗(yàn)并沒有影響試驗(yàn)雛鵝的精神狀態(tài)和飲食欲,全部健康成活,無手感體溫變化。剖檢部分試驗(yàn)雛,注射部位吸收良好,無硬結(jié)、腫脹、潰爛等肉眼可見的外觀病理變化,各組織器官均無眼觀病理變化。

2.1.3 雛鵝保護(hù)試驗(yàn) 試驗(yàn)組全部存活;對(duì)照組全部死亡。

2.1.4 瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn) 隨即抽取抗血清批號(hào)為090123,090212,090316,用標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清對(duì)其抗體檢測(cè),結(jié)果表明抗小鵝瘟血清與小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原在24 h內(nèi)出現(xiàn)清晰的沉淀線,效價(jià)分別為1∶32、1∶32和1∶64。

2.1.6 保存期測(cè)定結(jié)果 在4℃～8℃環(huán)境中保存,保存18個(gè)月其抗體效價(jià)沒有降低,證明抗血清在2℃～8℃條件下至少可保存18個(gè)月。

2.1.7 最佳預(yù)防劑量測(cè)定結(jié)果 接種抗血清后第5天用強(qiáng)毒攻擊,0.25 mL/只劑量組抗血清預(yù)防保護(hù)率為75%。0.5 mL/只和1.0 mL/只劑量組抗血清預(yù)防保護(hù)率均為100%。對(duì)照組全部死亡。0.5 mL/只劑量組可以作為臨床預(yù)防最小免疫劑量。

2.1.8 被動(dòng)免疫保護(hù)期的測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)雛鵝于注射抗血清后不同時(shí)間攻毒,第3、5、7 d攻毒各組0/20(死亡/存活),保護(hù)率為100%,對(duì)照組10/0(死亡/存活),保護(hù)率為0;第10 d組2/18(死亡/存活),保護(hù)率為 90%;對(duì)照組10/0(死亡/存活);第12和15天組保護(hù)率下降為75%～50%。剖檢對(duì)照組死亡鵝雛,有小鵝瘟典型病變。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,抗血清被動(dòng)免疫保護(hù)期為7 d～10 d。

2.1.9 治療最佳劑量測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn) 1組0.5 mL/只死亡 15只,治愈 25只,治愈率為62.5%,治療效果較差。試驗(yàn)2組1.0 mL/只治愈率為95%(38/40);試驗(yàn)3組 2.0 mL/只治愈100%(40/40);對(duì)照組10只全部發(fā)病,臨床上呈現(xiàn)典型的小鵝瘟癥狀,在7 d內(nèi)陸續(xù)死亡,死亡數(shù)為10/10。剖檢死雛均具有典型的小鵝瘟病特征性病理變化。故一次使用1.0 mL/只抗血清可作為臨床最佳治療劑量,治愈率為95%,對(duì)臨床癥狀較重和病程較長(zhǎng)的雛鵝可增加使用劑量或間隔1日再注射一次抗血清。

2.1.10 區(qū)域應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果 在吉林省部分地區(qū)進(jìn)行了抗血清的田間擴(kuò)大試驗(yàn),用于預(yù)防雛鵝524 800只,使用劑量為0.5 mL/只,預(yù)防保護(hù)率為95.57%;治療雛鵝 56 600只,使用劑量為 1 mL/只～3 mL/只,早期治愈率為92.87%。

3 小結(jié)

通過抗體檢測(cè)和臨床應(yīng)用結(jié)果表明,利用馬制備精制抗小鵝瘟血清是可行的。結(jié)果表明,馬源精制抗血清對(duì)初生雛鵝,用4倍量,試驗(yàn)雛鵝無不良反應(yīng)?？寡遄⑷腚r鵝體內(nèi),馬上產(chǎn)生抵抗小鵝瘟病毒的可靠的免疫能力,起到被動(dòng)免疫作用,皮下注射0.5 mL/羽,保護(hù)期達(dá)7 d～10 d,其保護(hù)率可達(dá)95.58%;對(duì)發(fā)病雛鵝群進(jìn)行早期治療,皮下注射1 mL/只～3 mL/只,其治愈可達(dá)92.87%。該抗血清具有保護(hù)率、治愈率高,保存期長(zhǎng)的特點(diǎn)。抗血清于4℃～8℃可保存18個(gè)月。區(qū)域試驗(yàn)證明,本產(chǎn)品使用簡(jiǎn)便、易于推廣應(yīng)用。

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Preparation and Application of Hyperimmune Serum Against Goose Parvovirus from Horse

LI Lin,SHAO Hong-ze,REN Ke-yan,MAO Wen-zhi,XU Zhi-lin,YAO Xin-hua

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science of Jilin,Changchun,J iLin,130062,China)

Hyperimmune serum against JLDA strain of goose parvovirus was obtained from horses.52.48 million goslings were immunized for prevention by injecting 0.5 mL of the hyperimmune serum per goose,and 5.66 million infected goslings were injected 1 mL-3 mL per goose for treatment.The protection rate was 95.58%,and the cure rate was 92.87%.The results showed that the hyperimmune serum is a highly effective and safe agent.Hyperimmune serum obtained from horses not only could effectively avoid the homologous animals being infected with other epidemic pathogens,but also could bring much ecnomic benefit,compared with hyperimmune serum from the goose.

Gosling plague;Goose parvovirus virus;hyperimmune serum from horse;preparation;application

S858.33

B

1007-5038(2010)09-0115-04*

2010-02-06

李 琳(1979-),男,吉林長(zhǎng)春人,助理研究員,碩士,主要從事動(dòng)物傳染病的診斷和防治的研究。