王義鵬,李向臣,蘇曉華,3,曹貴方,關(guān)偉軍*,馬月輝

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

解凍后的卵母細胞質(zhì)量評定方法研究進展

王義鵬1,2,李向臣1,蘇曉華1,3,曹貴方2,關(guān)偉軍1*,馬月輝1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

卵母細胞的冷凍保存可為體外受精、核移植、轉(zhuǎn)基因動物的研究提供更方便的材料來源,有助于優(yōu)秀家畜的保種,被廣泛應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域,同時可以避免胚胎研究過程中的倫理學(xué)和法律方面的限制。但是解凍后卵母細胞質(zhì)量的評定工作各國學(xué)者的方法標(biāo)準(zhǔn)不一,不利于進一步研究。論文將從細胞和分子水平就解凍后卵母細胞的質(zhì)量評定方法做一綜述,旨在為解凍后卵母細胞質(zhì)量的高效評定工作提供參考。

卵母細胞;解凍;質(zhì)量評定

*通訊作者

隨著胚胎工程技術(shù)的發(fā)展,卵母細胞需求量急劇增加,常規(guī)的活體采卵已經(jīng)不能滿足試驗的需要,雖然通過屠宰廠收集動物卵巢能獲得大量的卵母細胞,但由于不能長時間保存,同時受時間和空間的控制,都在一定程度上限制了胚胎工程及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。卵母細胞冷凍保存技術(shù)就是在這種背景下發(fā)展起來的一種生物學(xué)技術(shù),它可以充分利用各種動物卵母細胞資源,為胚胎工程的發(fā)展提供豐富的材料來源。盡管卵母細胞的冷凍保存是一項很有潛力的生物學(xué)技術(shù),國內(nèi)外學(xué)者為之進行了大量的研究,但是目前卵母細胞冷凍保存效果并不理想。冷凍保存會對卵母細胞造成一系列形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)以及生理、生化方面的影響。目前解凍后卵母細胞的質(zhì)量評定體系并不能全面反應(yīng)解凍后卵母細胞的質(zhì)量,這將不利于該技術(shù)的發(fā)展。本文綜述了目前國內(nèi)外常用的解凍后卵母細胞的質(zhì)量評定方法,以期為解凍后卵母細胞質(zhì)量評定體系的建立提供參考。

雖然解凍前后卵母細胞的評價方法很多,但是大多評價方法都是建立在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)之上的,本文將從這兩個方面綜述解凍后卵母細胞的評價方法。

1 以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的解凍后卵母細胞的評價方法

以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的解凍后卵母細胞的評價方法主要是從卵母細胞活率、受精率、胚胎發(fā)育率以及第一極體、卵周隙和胞質(zhì)形態(tài)等方面對解凍后的卵母細胞質(zhì)量做出評價,這些方法最直觀的反映了卵母細胞的質(zhì)量高低,也是卵母細胞質(zhì)量評價體系中最可靠的方法。

1.1 活率檢查法

卵母細胞的冷凍保存實質(zhì)上是一個脫水的過程,如果冷卻速率過快,水分來不及滲出,細胞內(nèi)會有大量冰晶形成,將對細胞造成致死性損傷;而卵母細胞特有的低體表面積/細胞容積的比率降低了細胞內(nèi)水分與細胞外冷凍保護劑的交換速度,也增加了細胞內(nèi)冰晶形成的可能及由此引起的細胞損傷,此外冷凍過程中使用的高濃度保護劑容易造成滲透壓損傷[1]。玻璃化冷凍技術(shù)與慢速冷凍相比有可以避免細胞內(nèi)冰晶的優(yōu)點[2],近幾年有取代慢速冷凍的趨勢[3-4],但也有研究者指出通過增加蔗糖濃度的方法可以達到類似玻璃化冷凍后的效果[5]。雖然通過改進冷凍保護劑[6]、改變蔗糖的濃度[7]等措施取得了較高的卵母細胞冷凍存活率,但是解凍卵母細胞的受精率和卵裂率都明顯降低。

通過活率檢查,可以直觀的反映冷凍效果的好壞,這也是目前評價解凍后卵母細胞質(zhì)量最常用的方法?；盥蕶z查方法有多種,FDA染色是比較常用的一種,用普通熒光顯微鏡便可快速確定細胞活率情況。評判標(biāo)準(zhǔn)如下:胞質(zhì)著色均勻,細胞形態(tài)完好即為活細胞;胞質(zhì)不著色,胞質(zhì)著色較淺、不均勻,細胞形態(tài)發(fā)生變化的細胞都歸為死細胞。

1.2 體外受精、體外胚胎培養(yǎng)檢測法

卵母細胞質(zhì)量的好壞直接影響卵母細胞的受精率、卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和維持、胎兒的發(fā)育,因此這些指標(biāo)是考察冷凍后卵母細胞質(zhì)量的可靠依據(jù)。冷凍過程中使用的二甲基亞砜、丙二醇、乙二醇等保護劑會提高卵母細胞內(nèi)鈣離子的濃度,從而導(dǎo)致卵母細胞透明帶硬化,降低卵母細胞受精率和發(fā)育到2-細胞的能力[8],使用無鈣冷凍液可以降低此有害作用[9];凍融液的溫度的選擇也將影響冷凍效果[10]。因此,應(yīng)用體外受精(IVF)、體外胚胎培養(yǎng)可以從宏觀角度最大程度地反映冷凍后卵母細胞質(zhì)量的高低。

盡管IVF、體外胚胎培養(yǎng)評定要耗費更多時間和人力、物力去檢驗卵母細胞質(zhì)量,相對快速評定有一定的滯后性,但這些評定方法體現(xiàn)了卵母細胞進一步發(fā)育的能力,是卵母細胞質(zhì)量高低最直觀的反應(yīng),是評價冷凍后卵母細胞質(zhì)量最直接的方法。

1.3 卵子第一極體、卵周隙及胞漿形態(tài)建立的評價方法

目前此方法也被廣泛應(yīng)用于卵母細胞解凍后的質(zhì)量評價,卵母細胞成熟過程中經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂,第1次減數(shù)分裂后期,促進復(fù)合物(anaphase promoting complex/cyclosome,APC/C)被激活,卵母細胞排出第一極體[11],形成卵周隙。極體的排出表明卵母細胞發(fā)育經(jīng)歷了正常的程序;而卵周隙越大,表明細胞質(zhì)收縮越厲害,導(dǎo)致卵母細胞質(zhì)量越差。根據(jù)卵子第一極體、卵周隙及胞漿形態(tài)將卵母細胞分級。Ⅰ級:第一極體完整,圓或卵圓,表面光滑,卵周隙和胞漿正常;Ⅱ級:第一極體完整,圓或橢圓,表面粗糙,卵周隙正常,胞漿異常;Ⅲ級:第一極體不完整、破碎,卵周隙和胞漿正常;Ⅳ級:第一極體巨大型,卵周隙過大,胞漿異常;Ⅴ級:第一極體破碎,卵周隙過大,胞漿異常。研究結(jié)果表明,I級卵母細胞體外受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率都顯著或極顯著高于其他各級形態(tài)的卵母細胞[12]。說明第一極體形態(tài),卵周隙大小和胞漿正常與否與卵母細胞的受精率和胚胎質(zhì)量相關(guān)密切;根據(jù)第一極體、卵周隙和胞漿形態(tài)可有效地評價解凍后的卵母細胞的質(zhì)量。

1.4 紡錘體形態(tài)觀測法

紡錘體是卵母細胞的一個重要組成部分,在第一次減數(shù)分裂期間隨著成熟促進因子濃度的增加紡錘體逐漸形成[13],由極間微管、染色體牽絲及區(qū)間牽絲排列組成。在細胞分裂過程中,紡錘體對卵母細胞染色體的平衡、運動、分配和極體的排出有非常重要的作用。紡錘體異常,會導(dǎo)致異常的減數(shù)分裂和異常受精,第二極體不能排放,形成多精受精或造成染色體數(shù)目異常,使胚胎進一步分裂受阻。

紡錘體對溫度的改變非常敏感[14],冷凍-解凍過程中很容易造成紡錘體的損傷[15]。研究發(fā)現(xiàn),解凍后的紡錘體組織不能維持原有的高度有序結(jié)構(gòu),在減數(shù)分裂任何時期冷凍保存都會引起紡錘體解體,但也有研究指出紡錘體可在解凍后3 h恢復(fù)[16];雖然GV期卵母細胞沒有紡錘體結(jié)構(gòu),并且GV期的卵母細胞玻璃化冷凍并不影響核成熟或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的連續(xù)性,但是正常胞質(zhì)的成熟會因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重聚而受阻斷[17]。

LC-PolScope紡錘體成像系統(tǒng)是一種能夠?qū)铙w細胞紡錘體進行無毒、無害觀測的技術(shù)。此系統(tǒng)在活體狀態(tài)下,能輕易地辨明紡綞體的位置與狀態(tài),不需對細胞進行固定或染色的步驟,因而使細胞免于受傷或死亡,觀察過紡錘體的卵子可以繼續(xù)受精培養(yǎng),進一步觀察卵母細胞的發(fā)育潛能[18-19]。朱亮等應(yīng)用此成像系統(tǒng)的觀察,結(jié)果顯示觀測中有紡錘體的卵母細胞的正常受精率和良好胚胎形成率均明顯高于無紡錘體的卵母細胞。這說明成熟卵母細胞紡錘體的存在可以反映其質(zhì)量的高低。因此運用此系統(tǒng)觀察解凍后經(jīng)培養(yǎng)的卵母細胞的紡錘體形態(tài)可以作為一種評判解凍后卵母細胞質(zhì)量高低的手段。

2 以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的解凍后卵母細胞質(zhì)量評價方法

以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的解凍后卵母細胞的質(zhì)量評價方法主要是應(yīng)用電泳、免疫熒光等分子生物學(xué)方法檢測解凍后卵母細胞的細胞器數(shù)量、形態(tài)等是否正常,從而間接反應(yīng)解凍后卵母細胞質(zhì)量的高低。

2.1 瓊脂糖電泳檢測卵丘顆粒細胞凋亡

顆粒細胞在卵母細胞體外成熟和體外受精進程中具有重要的作用,能顯著提高卵母細胞體外成熟和體外受精率。在卵母細胞體外成熟(IVM)技術(shù)中,卵的篩選標(biāo)準(zhǔn)之一是顆粒細胞的層數(shù)及完整性。顆粒細胞對卵母細胞的核成熟、胞漿成熟和保護其發(fā)育潛能有重要的作用,體外培養(yǎng)保留卵丘細胞可促進更多的卵母細胞發(fā)育成熟,增加優(yōu)質(zhì)胚胎率[18]。研究表明,所取卵周圍的顆粒細胞層數(shù)越多,顆粒細胞越完整,越有利于卵以后的發(fā)育,能顯著提高移植率。但是冷凍-解凍過程中會有顆粒細胞從卵母細胞表面丟失,還有部分顆粒細胞會發(fā)生凋亡,這些都將直接影響卵母細胞的發(fā)育潛能。

分別收集解凍后單卵的卵丘顆粒細胞,經(jīng)蛋白酶K、100 g/L十二烷基磺酸鈉(SDS)處理,放入37℃的水浴箱中輕搖過夜后,提取核DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)電泳結(jié)果可將解凍后的卵母細胞分為優(yōu)質(zhì)卵母細胞和非優(yōu)質(zhì)卵母細胞兩類,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后形成明顯DNA梯帶者為非優(yōu)質(zhì)卵母細胞;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳只形成1條～2條大分子質(zhì)量DNA條帶者為優(yōu)質(zhì)卵母細胞。其中優(yōu)質(zhì)卵母細胞適宜進行體外受精和核移植等操作,而非優(yōu)質(zhì)卵母細胞不適宜進行后續(xù)操作。

2.2 線粒體和細胞質(zhì)的區(qū)室化觀測法

線粒體作為細胞質(zhì)內(nèi)最重要的細胞器和能源基地,為卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育提供能量。長期以來,人們認為在哺乳動物卵母細胞和早期胚胎發(fā)育過程中線粒體的功能只是產(chǎn)生ATP,提供能量。近年來隨著研究的深入,卵母細胞和早期胚胎發(fā)育過程中線粒體的作用逐漸為人們所認識。除了在細胞代謝中起主導(dǎo)作用,其形態(tài)、數(shù)量及分布的變化與細胞的代謝水平、增殖及分化密切相關(guān)。卵母細胞成熟時線粒體由皮質(zhì)轉(zhuǎn)向胞質(zhì)中央?yún)^(qū)擴散,有利于卵母細胞成熟過程中能量的利用。因而線粒體的形態(tài)、數(shù)量及分布可以作為評定卵母細胞胞質(zhì)成熟度的依據(jù)。通過對哺乳動物卵母細胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察,提示線粒體超微結(jié)構(gòu)缺陷可能與早期胚胎發(fā)育阻滯或異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)受精失敗的卵母細胞內(nèi)線粒體呈空泡狀,數(shù)目明顯減少;發(fā)育阻滯的胚內(nèi)核周線粒體分布明顯減少,線粒體嵴伸長能力減弱,這些結(jié)果提示線粒體的數(shù)目和超微結(jié)構(gòu)會影響卵母細胞的受精和早期胚胎的發(fā)育[19]。這可能是由于線粒體超微結(jié)構(gòu)缺陷引起線粒體代謝水平與胞質(zhì)內(nèi)局部能量需求不協(xié)調(diào),引起線粒體氧化磷酸化水平異常,而引發(fā)早期胚胎發(fā)育阻滯或異常[20]。

冷凍保存會導(dǎo)致卵母細胞內(nèi)線粒體的損傷,主要表現(xiàn)在嵴不清楚或擴張、極性消失、分布發(fā)生紊亂等。Jones A等[21]研究指出,卵母細胞冷凍-解凍后線粒體分布極性的喪失,將導(dǎo)致受精時鈣離子信號傳遞受阻,并可能影響線粒體為受精提供能量。

細胞質(zhì)的區(qū)室化作用同樣被認為是協(xié)調(diào)胞核和胞質(zhì)成熟的重要因素[22]。線粒體的活性和在胞質(zhì)中的分布可作為胞質(zhì)區(qū)室化的標(biāo)記,是卵母細胞成熟變化特征的眾多標(biāo)志之一。在卵母細胞成熟過程中多數(shù)物種線粒體的分布形式和代謝活力均在不斷變化。胞質(zhì)中由微管網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的線粒體遷移運動過程對于卵母細胞體外成熟條件下獲得完整的發(fā)育能力是必需的。經(jīng)熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到卵母細胞中的線粒體以及胞質(zhì)中由微管網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的線粒體遷移運動[23]。

因此,通過熒光染色結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察卵母細胞線粒體、微管的分布可反映卵母細胞胞質(zhì)區(qū)室化的程度并能以此評定卵母細胞的質(zhì)量。

3 小結(jié)

以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的評定方法以不損傷細胞為目的,因而不會對細胞的進一步發(fā)育造成不利影響,非常適用于輔助生殖技術(shù)。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的評定方法是建立在卵母細胞細胞器以及生化變化基礎(chǔ)上,主要以測定細胞內(nèi)有關(guān)物質(zhì)的變化為手段,用于測定后的細胞不再具有進一步發(fā)育的能力,但測定結(jié)果具有可量化性、準(zhǔn)確性和客觀性,適用的范圍更加的廣泛。雖然這些評定方法都有各自的優(yōu)點,但也有不可避免的缺陷,隨著評定體系的完善,也必將推動卵母細胞冷凍技術(shù)的進一步發(fā)展[24]。

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Progress on Quality Assessment of Oocytes After Thawing

WANG Yi-peng1,2,LI Xiang-chen1,SU Xiao-hua1,3,CAO Gui-fang2,GUAN Wei-jun1,MA Yue-hui1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing,100193,China;
2.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia,010018,China;
3.College of Wildli fe Resources,Northeast Forestry University,Harbin,Heilongjiang,150040,China)

Cryopreservation of oocytes can provide more convenient material resources forin vitrofertilization,nuclear transplantation and the development of transgenic animals,also it contributes to preservation of excellent livestock breeds.This technique is used extensively in the field of assisted reproduction,avoiding the ethical and legal restrictions in embryo researches.However,there has no unified method for assessment of oocytes after thawing among the scholars from various countries,which is not conducive to further studies.In this paper,the quality assessment methods of oocytes after thawing were reviewed in order to offer a reference for efficient quality assessment of oocytes.

oocytes;thawing;quality assessment

S821.36

A

1007-5038(2010)09-0101-04

2010-03-15

國家科技支撐計劃項目(2006BAD13B08;2008BADB2B01);轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2008ZX08009-003);“863”課題(2006AA10Z198)

王義鵬(1983-),男,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事動物組織胚胎與發(fā)育生物學(xué)研究。