劉佳麗,張喜宏,姜英武,谷春華,高云航*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,吉林長春130118;2.吉林省敦化市牧業(yè)管理局,吉林敦化133700)

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎,是一種由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起家鴨、鵝、火雞等多種家禽廣泛性纖維素性滲出為特征的急性或慢性傳染病。亦有報道從野禽和家養(yǎng)豬中分離到本菌[1]。本病目前呈全球性發(fā)生,發(fā)病率和病死率均較高,對養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。RA血清型眾多,且各血清型之間無交叉保護力。目前公認有21個型(1～21型),并不斷有新的血清型被發(fā)現(xiàn)[2]。目前國內(nèi)外學(xué)者均致力于本病致病機理、耐藥機理、免疫原性等病原分子生物學(xué)方面研究。

1 毒力相關(guān)基因的研究

RA感染是一個復(fù)雜、動態(tài)的多因子作用過程,涉及眾多毒力基因產(chǎn)物即毒力因子的協(xié)同作用。目前國內(nèi)外對毒力相關(guān)基因研究尚處于起步階段。

1.1 質(zhì)粒

Chang C F等[3]首次報道大部分RA菌株含有質(zhì)粒,并將其中一個3.9 kb的質(zhì)粒命名為pCFC1,包含4個長的開放閱讀框(ORF)即VapD1、VapD2、RepA1和RepA2。其中VapD1和VapD2編碼的蛋白質(zhì)與毒力有關(guān),并且證明VapD1序列僅存在于含質(zhì)粒的RA菌株中。Weng S C等[4]從大小為5.6 kb的質(zhì)粒pCFC2中發(fā)現(xiàn)一個插入序列元件ISRal,為編碼毒力相關(guān)類蛋白基因,并且為首次在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的插入序列。

1.2 環(huán)化腺苷-磷酸溶血素-唾液酸蛋白酶

Crasta K C等[5]建立了RA基因文庫,通過金黃色葡萄球菌進行環(huán)化腺甘-磷酸CAMP反應(yīng)篩選陽性克隆,獲得協(xié)同溶血素基因cam,并證明其為一種中性金屬蛋白基因,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析,表達產(chǎn)物為37 ku的唾液酸蛋白酶。CAMP可能為RA毒力決定因子,其cam基因為所有RA毒株所共有。CAMP活性可被螯合劑等抑制,具有免疫原性,并可協(xié)同產(chǎn)生溶血作用。

1.3 二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)及鋅依賴肽酶(zdp)

鄭娟[6]用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)技術(shù)篩選1型鴨疫里氏桿菌(RA-YM)在感染過程中特異性表達基因,篩選到2個編碼蛋白酶的基因,即二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)和鋅依賴肽酶(zdp)。推測二肽肽酶Ⅳ可能為RA引起主要病理變化——腹腔漿膜面廣泛性纖維素性滲出的關(guān)鍵性毒力因子之一。

1.4 Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因

陳虹[7]應(yīng)用血清Ⅰ型RA CH-1株表達型DNA文庫進行免疫篩選,篩選出一段4 434 bp的插入DNA片段。同源性分析表明,該基因是一種新的Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因,對其進行重組及原核表達,誘導(dǎo)表達出大小約為80 ku的PDE1重組蛋白。免疫印跡檢測結(jié)果表明該重組表達蛋白具有較好的免疫原性。

1.5 明膠水解酶

多種細菌分泌的具有水解明膠活性的胞外蛋白酶與致病性有關(guān),為重要毒力因子。RA部分菌株具有液化明膠特性。唐妤[8]對RA部分特性研究,RA明膠水解粗酶對試驗鴨肝臟、大腦、心臟、脾臟可以造成一定病理性損傷。李繼祥等[9]從RA AF株培養(yǎng)濾液中分離獲得能水解明膠及改變細胞形態(tài)的活性蛋白質(zhì),分子質(zhì)量約為55 ku,證實為降解明膠的蛋白水解酶,是鴨疫里氏桿菌培養(yǎng)濾液影響鴨胚成纖維細胞形態(tài)的活性物質(zhì),可能是細菌毒力因子之一。

1.6 熱休克蛋白Hsp20和轉(zhuǎn)座酶

劉燕等[10]應(yīng)用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)對血清2型鴨疫里氏桿菌強毒株及其體外傳代200代(RA200)的弱毒菌株外膜蛋白進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,獲得重復(fù)性好的差異表達蛋白質(zhì)點數(shù)3個,經(jīng)膠內(nèi)酶解和肽質(zhì)量指紋圖譜分析,W1為熱休克蛋白Hsp20家族成員,W2、W3為轉(zhuǎn)座酶,推測它們可能與里氏桿菌的毒力密切相關(guān)。

2 耐藥相關(guān)因子的研究

細菌耐藥性的產(chǎn)生機制分為自發(fā)性基因突變和耐藥基因摻入,細菌耐藥基因不僅由其染色體攜帶,還常由染色體外的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)或整合子(integron,int)攜帶,通過融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化在不同種屬的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或集聚重排造成多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升。從臨床實踐可以看出,由于大量抗生素及抗菌藥用于治療鴨疫里氏桿菌病,造成鴨RA耐藥現(xiàn)象日益增多,耐藥率高且廣泛,交叉耐藥性多[11]。

2.1 氨基糖苷類修飾酶-3′核苷轉(zhuǎn)移酶I

劉穎等[12]首次在RA中檢測出了氨基糖苷類修飾酶——3′核苷轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(ant(3′)-Ⅰ)基因,產(chǎn)生氨基糖苷類耐藥的基因是通過氨基糖苷類修飾酶(AMES)對進入胞內(nèi)的活性分子進行修飾使之失去生物活性。此研究對RA產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素耐藥的分子機制提供了基礎(chǔ)。

2.2 螺旋酶gyrA

劉穎等[13]用PCR技術(shù)擴增26株RA的部分螺旋酶gyrA序列,通過與大腸埃希菌(ABA36537)比較氨基酸序列找到了對喹諾酮類抗菌藥耐藥菌株的基因突變點和突變規(guī)律,為研究RA對喹諾酮類抗菌藥耐藥的分子機制提供了基礎(chǔ)。孫亞妮[14]對臨床分離的31株RA,對其螺旋酶區(qū)進行測序,尋找RA對喹諾酮類抗菌藥耐藥菌株的gyrAQDRD突變熱點和突變規(guī)律。結(jié)果表明,31株諾氟沙星耐藥菌株均出現(xiàn)了gyrA基因突變,而環(huán)丙沙星耐藥菌株基因突變沒有明顯規(guī)律性。

2.3 基因盒-整合子系統(tǒng)

蔡秀磊[15]應(yīng)用PCR技術(shù)對鴨疫里氏桿菌浙江分離株進行基因盒-整合子系統(tǒng)檢測。從分子水平上研究該菌耐藥性產(chǎn)生與傳播機制。整合子可變區(qū)擴增得到兩種大小不同基因盒,長度分別為1 048 bp(InI-A)和2 352 bp(InI-B)。InI-A中含有一個耐藥基因盒aadA5基因,編碼核苷轉(zhuǎn)移酶,導(dǎo)致細菌對氨基糖甙類藥物產(chǎn)生耐藥性。InI-B含有長度為555 bp的aac6-Ⅱ基因,編碼?；D(zhuǎn)移酶,引起細菌對氨基糖苷類藥物耐藥;長度為633 bp的catB3基因,編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對氯霉素產(chǎn)生耐藥性;長度為792 bp的aadA1基因,編碼核苷轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對氨基糖苷類藥物耐藥。以上結(jié)果表明,RA存在與其他細菌同源性極高的Ⅰ型整合子結(jié)構(gòu),推測認為與分離菌株多重耐藥性有關(guān)。

2.4 生物膜的研究

很多微生物的耐藥性與生物膜的產(chǎn)生息息相關(guān)[16]。Hu Q H等[17]發(fā)現(xiàn),RA中的生物膜對抗生素和去污劑有很好的抵抗作用,同時認為生物膜的產(chǎn)生是造成RA持續(xù)感染的重要因素。

2.5 雙耐藥RA融合菌株的構(gòu)建

蔡良水[18]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建雙耐藥RA融合菌株,分別選用氯霉素(Chi)和紅霉素(Ery)對RA-JX菌株(l型)和RA-2菌株(2型)進行耐藥性標記,分別獲得遺傳特性穩(wěn)定的耐藥性標記菌株RAC(Chlr,Erys)(1型)和RAE(Eryr,Chls)(2型)。鴨疫里氏桿菌血清1型和2型雙耐藥融合菌株的成功構(gòu)建,為鴨疫里氏桿菌新型疫苗的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

3 DNA指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用

Rimler R B等[19]將17種限制性核酸內(nèi)切酶用于RA的DNA指紋圖譜研究,發(fā)現(xiàn)不同來源RA基因存在明顯差異,即使來自同一地區(qū)同一禽類的分離株相同血清型RA菌株,其DNA指紋圖譜也有所不同。Huang B等[20]通過回文結(jié)構(gòu)序列PCR(repetitive sequence based-PCR,Rep-PCR),以基因外重復(fù)回文序列為引物,對18個血清型35株RA進行基因外重復(fù),發(fā)現(xiàn)不同血清型Rep-PCR指紋圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性,相同血清型而流行病學(xué)上不相關(guān)的菌株經(jīng)Rep-PCR擴增后的指紋圖譜也存在不同。結(jié)果表明Rep-PCR技術(shù)也許可以成為對RA血清亞型鑒定的一種分子工具。程龍飛等[21]以Rep-PCR技術(shù),將分屬于8個血清型40株RA區(qū)分為12個不同基因型,不同血清型RA圖譜有明顯差異,相同血清型RA圖譜也有所不同。

4 16 S rDNA特性分析

Subramaniam S等[22]通過對4株RA編碼16 S rRNA的基因序列進行比較分析,發(fā)現(xiàn)其基因序列相似,同源性高達99%～99.5%。其16 S rRNA基因經(jīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)表明即使是同一血清型不同RA菌株,其16 S rRNA基因仍有差異。

5 RA相關(guān)免疫蛋白

RA免疫相關(guān)蛋白的研究主要集中在莢膜蛋白和外膜蛋白(OmpA)。

5.1 莢膜蛋白

蘇敬良等[23]對1型RA莢膜提取物免疫原性結(jié)果表明,莢膜粗提物和經(jīng)過苯酚抽提純化后的莢膜提取物均能有效刺激鴨機體產(chǎn)生抗體,對同源細菌攻毒保護率分別為90%和70%。粗提莢膜可直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),而莢膜多糖分子純化過程中構(gòu)型可能發(fā)生改變,從而影響其免疫原性。齊冬梅等[24]用鹽浸法提取I型RA莢膜粗提物并制成油佐劑疫苗,獲得較好免疫保護效果(9/10)。

5.2 外膜蛋白

朱德康[25]對5種血清型RA外膜蛋白(OmpA)SDS-PAGE圖譜比較分析結(jié)果表明,其外膜蛋白電泳圖譜具有一定相似性,不同血清型菌株外膜蛋白之間存在交叉免疫原性,74 ku和31 ku外膜蛋白是重要交叉免疫原性蛋白。程安春等[26]采用超聲波裂解法和超速離心法提取血清2型RA外膜蛋白,經(jīng)過透射電鏡觀察、免疫印跡證實,血清2型RA 40 ku外膜蛋白為主要免疫原蛋白,用分離的外膜蛋白加上弗氏佐劑制備的亞單位疫苗免疫雛鴨后,可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的抗體。劉文華等[27]等利用PCR技術(shù)擴增標準血清2型RA 42 000外膜蛋白基因片段(OmpA-2)1 045 bp,并將其克隆和表達,獲得分子質(zhì)量約為65 ku融合表達蛋白?；舸涿返萚28]參照已知RA OmpA序列設(shè)計1對特異性引物,經(jīng)PCR擴增得到目的片段約1 200 bp,經(jīng)測序與標準序列核苷酸同源性達99.8%;誘導(dǎo)表達后,經(jīng)SDS-PAGE分析表明,OmpA獲得高效表達,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與1、2、10、11型全菌兔血清呈陽性,而與陰性兔血清不反應(yīng),說明表達蛋白具有高度免疫反應(yīng)特異性。

6 隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)

汪銘書等[29]以4株不同血清型RA、5株不同血清型鴨源致病性大腸埃希菌和5株同一血清型鴨沙門菌為研究對象,利用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對其基因組DNA進行分析,篩選出一條引物G12,結(jié)果顯示電泳圖譜中535 bp的條帶為鴨疫里氏桿菌所特有,330 bp條帶為沙門菌所特有,1 227 bp條帶為大腸埃希菌所特有,表明G12可作為分子標記用來鑒別3種細菌。

7 單克隆抗體的制備

覃志初等[30]首次嘗試RA單克隆抗體(McAb)的研制,成功的研制出RA外膜蛋白McAb,并建立了靈敏度高、特異性好的RA單克隆抗體篩選方法,為RA單克隆抗體在鴨傳染性漿膜炎的防治及相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

8 基因文庫的構(gòu)建

目前關(guān)于RA基因文庫構(gòu)建的研究較少,僅對1型、2型RA進行部分基因庫構(gòu)建,具有一定成效,可為進一步研究RA的致病和耐藥機制提供依據(jù)。

朱德康等[31]以血清1型RA CH21株為材料,成功構(gòu)建其部分基因組文庫,研究發(fā)現(xiàn)其含有1個編碼369個氨基酸的完整開放閱讀框架,為尚未見報道的RA基因序列,且存在多個預(yù)測抗原表位。吳芳等[32]以RA 2型毒力株RA F2及弱毒力株LY-58為研究對象,通過抑制性差減雜交(SSH)技術(shù),構(gòu)建DNA差減文庫,從RA F2株中獲得14個特異性差異基因片段。經(jīng)同源性分析,其中6個差異基因片段分別與外膜蛋白、ATP結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、氨基酸通透酶、胞外蛋白編碼基因具有同源性,為可能毒力基因。利用PCR對差異基因片段在不同血清型RA中的分布進行檢測,結(jié)果表明,除8型外,以上差異基因片段在RA中分布普遍。

9 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體比較特殊,外源DNA比較容易進入細胞內(nèi),制備原生質(zhì)體后再進行轉(zhuǎn)化是一個非常好的選擇,特別對于那些難以轉(zhuǎn)化的細菌來說提供了一條新途徑,轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵在于原生質(zhì)體的制備。RA是一種非常難以轉(zhuǎn)化的細菌,國內(nèi)外未見關(guān)于其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的報道。王勇等[33]試驗以鴨疫里氏桿菌OD600為0.7時為受體菌,在高滲緩沖液中,經(jīng)溶菌酶5 mg/mL于37℃作用50 min,制備的原生質(zhì)體再生于再生雙層固體培養(yǎng)基,原生質(zhì)體成功再生。此研究為RA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化提供了一條新途徑。王春平等[34]以耐藥標記的RA TXRA1(Chlr,Erys)為親本菌株,在DNase I始終存在的條件下,采用Lysozyme-EDTA法制備原生質(zhì)體,然后在高滲瓊脂平板上再生,成功獲得了92%的原生質(zhì)體制備率和38.77%的再生率。

10 噬菌體技術(shù)的應(yīng)用

程龍飛等[35]探索RA生物學(xué)療法,對健康番鴨糞便進行分離富集,獲得1株RA敏感的烈性噬菌體,命名為RA P15。該噬菌體可裂解2株鴨疫里氏桿菌(RA f6和RA f71),說明噬菌譜較窄。透射電鏡觀察顯示,該噬菌體由呈多面體的頭部(直徑約55 nm)和細長的尾部(長約200 nm)組成。RA P15基因組可以被DNaseⅠ消化,但不能被RNaseA和綠豆核酸酶消化,提示其核酸類型為雙股DNA。形態(tài)學(xué)和分子特征提示,RA P15屬于長尾病毒科。

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