顏培宇,朱志中,王 芳,唐 強(qiáng)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040)

人體免疫系統(tǒng)在抑制疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。機(jī)體在疾病或應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)免疫活性細(xì)胞數(shù)目減少或亞群改變,細(xì)胞因子表達(dá)或分泌異常,免疫抑制性因子活性增強(qiáng),從而導(dǎo)致機(jī)體防御及保護(hù)能力下降的免疫功能抑制。惡性腫瘤、不孕不育、腦血管病、艾滋病等都存在免疫抑制現(xiàn)象[1]。實(shí)驗(yàn)研究表明正氣虛則細(xì)胞免疫功能低下、非特異性免疫功能降低,如體液免疫中 IgG和 IgM水平下降。因此,認(rèn)為免疫抑制屬中醫(yī)虛證范疇。應(yīng)用針灸學(xué)、現(xiàn)代免疫學(xué)理論和多學(xué)科方法或技術(shù),研究針灸施于腧穴后對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響及其機(jī)理已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。有關(guān)其作用機(jī)制的探索同樣備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以免疫抑制大鼠為模型,探討不同穴位針刺后對(duì)免疫抑制機(jī)體T細(xì)胞極化及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,闡明針刺調(diào)整免疫功能的分子免疫學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康 SD雄性大鼠 45只,體重200～250 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)scxk(京 )2007-0001)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

環(huán)磷酰胺(CTX)：由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供(批號(hào) 09041121);大鼠白介素 -4(IL-4)、大鼠干擾素 -r(IFN-r)ELISA試劑盒：由上海西唐生物科技有限公司提供;化學(xué)藥品純?yōu)趵梗簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào) 20080319;生理鹽水：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號(hào) 090504C2。

1.3 主要儀器

洗板機(jī)(Anthos 2010,type：24600,Austria.);離心機(jī)(LDZ4-2自動(dòng)平衡離心機(jī),江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);酶標(biāo)儀(Anthos 2010,type：17550,Austria.)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠隨機(jī)分為 5組：正常對(duì)照組(A組),模型對(duì)照組(B組)、模型加頭針組(C組),模型加體針組(D組),模型加頭針體針組(E組)。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組每天捆綁不針刺。

2.2 造模方法

取鼠后,飼養(yǎng)環(huán)境控制室溫(22±1)℃,12 h光暗交替(7：00～19：00照明)。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室最初 4天為適應(yīng)環(huán)境期,自由進(jìn)食和飲水,并每日撫摸 2～3 min,以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員操作。于實(shí)驗(yàn)第 5天除正常對(duì)照組外,各組均腹腔注射新鮮配制的環(huán)磷酰胺注射液,劑量 50 mg/kg體重 3天,第 4天加強(qiáng)注射 1次,制備免疫抑制模型[2]。正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

2.3 穴位定位及針刺方法

2.3.1 選穴及定位 選穴：頭穴(百會(huì)及四神聰)、體穴(足三里、關(guān)元)。取穴定位：參照“十一五”國(guó)家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》和《俞穴學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖定位及擬人對(duì)照法定位。足三里穴區(qū)取穴膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約 5 mm處取之;關(guān)元區(qū)位于大鼠兩后肢、根部連線的中點(diǎn);頭穴區(qū)取穴 “百會(huì)”在大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點(diǎn)(相當(dāng)于人體百會(huì)穴),旁開 4 mm叢刺兩針。

2.3.2 針刺方法 各組大鼠綁縛固定,針具選擇華佗牌 30號(hào) 1寸針灸針[3],各穴進(jìn)針 3～10 mm,留針 20 min。每隔 5 min進(jìn)行補(bǔ)法捻針。每日 1次,治療 7天。

2.4 標(biāo)本采集

2.4.1 取血清 于實(shí)驗(yàn)第 8日按 0.5 ml/100 g給大鼠腹腔注射 25%烏拉坦,麻醉后用負(fù)壓采血管心臟取血 4 ml左右;采血后將采血管放入 4℃冰箱靜置 6 h,取出后 3000 r/min,離心 10 min;吸取上清液,移入小試管中,-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 取全血 于實(shí)驗(yàn)第 8日按 0.5 ml/100 g給大鼠腹腔注射 25%烏拉坦,麻醉后用負(fù)壓肝素抗凝血采血管心臟取血 1 ml左右,肝素抗凝血。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.5.1 外周血 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法 取肝素抗凝血 1 ml于小試管底部,分別加 20熒光標(biāo)記的抗單克隆抗體,混勻,室溫(18～25℃)孵育15 min。加紅細(xì)溶解液 1 mL充分混勻。待紅細(xì)胞完全溶解后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在波長(zhǎng) 488 nm時(shí),FITc(異硫氰酸熒光素)呈蘭 -綠熒光,PE(藻紅蛋白)呈橙紅色熒光,計(jì)數(shù) 30000個(gè)細(xì)胞。記錄分析直方圖,據(jù)經(jīng) ELITE軟件處理,以百分率報(bào)告。

2.5.2 血清 IFN-r及 IL-4含量檢測(cè) 采用 ELISA法檢測(cè)血清 IFN-r及 IL-4含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組組間差異采用方差分析,以 P＜0.05作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

共納入大鼠 40只進(jìn)入結(jié)果分析(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中麻醉意外死亡 2只、針刺過(guò)程中感染死亡 3只)。

3.1 實(shí)驗(yàn)各組 T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,頭穴加體穴組(E組)可明顯提高免疫抑制大鼠外周血 CD4+TC含量(12.82±4.15),顯著高于 A、B、C、D組(P＜0.05);外周血 CD8+TC的含量治療前后無(wú)明顯變化(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠外周血TC和TC的含量 (±s)

表1 各組大鼠外周血TC和TC的含量 (±s)

注：與 B組比較,**P＜0.01;與 A組比較,▲P＜0.01,▲▲P＞0.05;與 E組比較,*P＜0.05。

組別 n CD4+TC(%) CD8+TC(%)A組 8 12.07±3.99 6.48±0.14 B組 8 6.54±3.15▲ 6.37±0.11▲▲C組 8 11.85±5.59* 6.39±0.13▲▲D組 8 10.1±3.59* 6.41±0.12▲▲E組 8 12.82±4.15** 6.38±0.13▲▲

3.2 實(shí)驗(yàn)各組 IFN-r及 IL-4表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,B組血清 IFN-r水平顯著降低,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01)。C、D、E組都可提高免疫抑制大鼠血清 IFN-r水平(P＜0.05或 P＜0.01),E組療效優(yōu)于其它各組(P＜0.05)。B組血清 IL-4水平顯著升高,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01)。C、D、E組都可降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平(P＜0.05),E組療效優(yōu)于其它各組(P＜0.05)見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠外周血 IFN-r和 IL-4的含量 (±s)

表2 各組大鼠外周血 IFN-r和 IL-4的含量 (±s)

注：與 A組比較,*P＜0.01;與 B組比較,▲▲P＜0.01;▲P＜0.05。

組別 n IFN-r(pg/ml) IL-4(pg/ml)A組 8 29.37±16.65 6.92±1.88 B組 8 11.73+8.74C* 9.49+1.98*C組 8 19.28+3.82▲ 8.49+6.47▲D組 8 21.57+8.09▲ 7.08+5.67▲E組 8 25.03+7.63▲▲ 7.00+6.65▲

4 討論

大量的臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí),針灸對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用。其中針灸調(diào)節(jié) T淋巴細(xì)胞的功能是針灸治療多種疾病的重要機(jī)制之一[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)針灸不僅可以提高 T細(xì)胞及其亞群在外周血的比率,還能增強(qiáng)它的活性[4]。研究證實(shí),針刺可提高束縛型大鼠血清 IL-2的含量[5]。輔助性 T淋巴細(xì)胞(helper T cell,Th)對(duì)機(jī)體的免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用,CD4+T細(xì)胞按細(xì)胞因子的產(chǎn)生模式和生物學(xué)活性,有兩種不同的亞群,分別為 Th1和 Th2,Th1細(xì)胞主要分泌 IL-2、IFN-r和 TNF-β,稱為 Th1型細(xì)胞因子;Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,稱為 Th2型細(xì)胞因子[6]。IFN-r能夠促進(jìn) Th1細(xì)胞的分化,IL-4是 Th2分化的必需因子。Th細(xì)胞亞群是一個(gè)綜合的免疫指標(biāo),便于評(píng)估機(jī)體免疫平衡狀態(tài)和整體的免疫功能,具有很好的應(yīng)用性。本實(shí)驗(yàn)選取IFN-r和 IL-4兩個(gè)細(xì)胞因子指標(biāo),探討針刺對(duì)免疫抑制機(jī)體的 T細(xì)胞亞群調(diào)整作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),針刺可以顯著提高 IFN-r水平,降低 IL-4水平,使機(jī)體的免疫應(yīng)答向 Th1方向轉(zhuǎn)化,具有增強(qiáng)免疫抑制機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。頭針加體針的療效最佳,優(yōu)于其它各治療組(P＜0.05)。

環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不同程度的免疫抑制現(xiàn)象,是公認(rèn)制備免疫抑制模型的方法[2]。中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi),邪不可干;邪之所湊,其氣必虛”。中醫(yī)所認(rèn)為的虛證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所認(rèn)為的免疫力低下、免疫抑制非常相似。故可以采用中醫(yī)藥治療虛證的方法來(lái)治療免疫抑制性疾病。針刺可以提高機(jī)體的免疫功能,常用的腧穴有“足三里”、“關(guān)元 ”等強(qiáng)壯穴?！白闳铩焙汀瓣P(guān)元”都可以通過(guò)神經(jīng) -內(nèi)分泌 -免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)整機(jī)體的免疫功能[7],具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體抗病能力的作用。百會(huì)頭穴區(qū)在臨床廣泛用于腦血管疾病的康復(fù)治療,取得滿意的療效。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：頭穴叢刺法具有提高腦缺血大鼠平衡、行走及抓握能力,增強(qiáng)患側(cè)肌力的作用;能夠增加缺血半影區(qū)微管相關(guān)蛋白 -2和突觸素的表達(dá);能夠增加突觸數(shù)目,保護(hù)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)基本完整,增加突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及突觸后致密物質(zhì)厚度。但頭穴對(duì)免疫抑制機(jī)體的免疫功能影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以免疫抑制大鼠為模型,探討了頭穴加體穴配合方法對(duì)免疫抑制大鼠的 T細(xì)胞極化及相關(guān)細(xì)胞因子的影響,為針刺臨床治療免疫抑制性疾病提供了有力證據(jù)。

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