客 蕊,朱文增,東貴榮,李紅穎,倪金霞

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150001;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;4.黑龍江省第二人民醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150010)

頭穴叢刺可以促進(jìn)腦卒中患者神經(jīng)功能的恢復(fù),同時(shí)頭穴叢刺的作用機(jī)制研究,也是針灸學(xué)術(shù)發(fā)展的重要問題。腦卒中是中老年常見病之一,具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn)[1]。腦梗死后超早期進(jìn)行溶栓治療可以搶救梗死灶邊緣區(qū)尚未死亡的缺血神經(jīng)細(xì)胞,然而梗死病灶中心神經(jīng)元死亡引起的神經(jīng)功能缺損至今無確切有效的治療方法。目前,越來越多的證據(jù)表明,頭穴叢刺能較大程度地降低神經(jīng)功能缺損的程度和提高生活質(zhì)量。急性腦梗死的病理改變包括充血、水腫、壞死,從而造成神經(jīng)元細(xì)胞的缺失及功能喪失,針刺對神經(jīng)元形態(tài)及功能調(diào)節(jié)、促進(jìn)其恢復(fù)(結(jié)構(gòu)的重構(gòu)及功能的重組)具有重要意義。

生長相關(guān)蛋白 -43(GAP-43)是一種富含于生長錐中的神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白質(zhì),它廣泛存在于神經(jīng)組織中,尤其是在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高,是一種神經(jīng)軸突的生長蛋白,這種蛋白在樹突上不存在。在神經(jīng)元的生長、發(fā)育和再生過程中,GAP-43伴隨著軸突的生長在神經(jīng)組織內(nèi)大量合成,參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié),被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠腦梗死及針刺后 GAP-43的動態(tài)變化,研究神經(jīng)可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能機(jī)制,并探討針刺的影響,以便進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康雄性 wistar大鼠,體重 200～280克,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表將 132只大鼠隨機(jī)分為 4組：假手術(shù)組(A),模型組(B組),頭穴透刺組(C組),頭穴叢刺組(D組)。以上各組分成 3個(gè)時(shí)間點(diǎn),即為造模 7天、14天、28天,每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 11只,均做神經(jīng)功能評分,取 8只做 PCR檢測。

1.2 模型的建立

栓線的處理：選用直徑 0.20～0.25 mm的強(qiáng)力釣魚線,剪成長 40 mm的栓線,線前端經(jīng)酒精燈處理形成光滑球形,在手術(shù)顯微鏡下觀察其光滑程度,不合格的剔除,合格栓線,消毒后放入生理鹽水中備用。

操作：室溫條件下,大鼠稱重后,用 10%水合氯醛35 mg/kg,腹腔麻醉后,仰臥固定在手術(shù)臺上,頸部備皮,常規(guī)消毒后行正中切口,鈍性分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)。鈍性分離頸內(nèi)動脈(ICA),備線并打一活結(jié),在 ICA遠(yuǎn)端用微動脈夾夾閉,在 CCA分叉部切一小口,將與體重相應(yīng)直徑的栓線插入,收緊備線,打開動脈夾,栓線進(jìn)入 ICA,輕柔推進(jìn),當(dāng)線端進(jìn)入 17～21 mm時(shí)可感到有一定阻力即停止推送。這樣就在 ICA顱內(nèi)分叉處阻斷了流入大腦中動脈(MCA)的所有血液。扎緊備線,固定纖維縫合,切口局部撒消炎粉。假手術(shù)組只分離動脈,不結(jié)扎插線。模型成功的標(biāo)志是：①患側(cè)肢體的疼痛回縮遲鈍或消失;②提尾倒懸時(shí)患側(cè)上肢不能前伸;③爬行時(shí)向患側(cè)偏斜。

1.3 治療方法

假手術(shù)組(A)于大鼠術(shù)后清潔飼養(yǎng);模型組(B)于術(shù)后清潔飼養(yǎng),不予以任何治療;頭穴透刺組(C)于大鼠造模 24 h后進(jìn)行頭針治療,取百會透曲鬢;頭穴叢刺組(D)于大鼠造模 24 h后進(jìn)行頭針治療,取百會穴及百會左、右側(cè)各旁開 4 mm處針刺,進(jìn)行快速針刺,捻轉(zhuǎn) 1 min后留針 30 min,每日 1次,6天為 1個(gè)療程,1個(gè)療程結(jié)束后休息1天,進(jìn)行下一療程,7天組治療 1個(gè)療程,14天組治療 2個(gè)療程,28天組治療 4個(gè)療程。

1.4 神經(jīng)功能評定

按 Bederson[2]等制定的標(biāo)準(zhǔn)評分,評分分為 4級。0級(分 )：未見行為缺陷;1級 (分)：前肢屈曲 ;2級 (分)：側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽性)伴前肢屈曲,無轉(zhuǎn)圈行為;3級(分)：同 2級行為伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。

1.5 取材

各組大鼠在造模術(shù)后 7天、14天、28天時(shí)間點(diǎn)迅速斷頭取腦,暴露被覆蛛網(wǎng)膜的腦組織,換用經(jīng)過高溫高壓處理、DEPC水浸泡過的器械,剔掉蛛網(wǎng)膜取出腦組織,置于干冰上,迅速分離各部位腦組織,分析天平稱重,快速放入已標(biāo)記好的凍存管內(nèi),置于液氮中保存?zhèn)溆?整個(gè)過程不超過 3 min。

1.6 RT-PCR法檢測腦組織 GAP-43mRNA的表達(dá)

提取總 RNA;RNA逆轉(zhuǎn)錄;DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：①每個(gè) PCR擴(kuò)增管中加總量 25μL下述混合液(20μL反應(yīng)體系：模板 cDNA1.0μL,5 ×緩沖液5.0 μL,10 mmol/LdNTP2.0μL,Taq酶 1.0 μL,上 、下游引物各 0.5μL,加入雙蒸水至 25μL);②震蕩,略離心上述混合液;③PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：變性,95℃30 s;退火 ,7℃60 s;延伸,59℃60 s。共做 26個(gè)循環(huán)后(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定循環(huán)次數(shù)),72℃延伸 5 min。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分

表1 各組神經(jīng)功能評分比較

見表 1。經(jīng) q檢驗(yàn),組內(nèi)不同時(shí)間窗比較：模型組在 24 h和 7天時(shí)神經(jīng)功能評分比較無顯著性差異(P＞0.05),但在 14天、28天時(shí)與 24 h、7天比較均具有顯著性差異(P＜0.05),可見隨著缺血時(shí)間的延長,模型組神經(jīng)功能缺損有一定程度的自發(fā)性逐漸恢復(fù),這可能與腦水腫的減輕、恢復(fù)再灌有關(guān);頭穴叢刺組和頭穴透刺組在 28天時(shí)神經(jīng)功能評分分別與 24 h、7天和14天時(shí)比較,均具有顯著性差異(P＜0.05)。

組間不同時(shí)間段造模 24 h后頭穴叢刺組、頭穴透刺組及模型組分別與假手術(shù)組比較,均有顯著性差異(P＜0.05),說明造模比較理想;而造模 24 h后頭穴叢刺組、頭穴透刺組及模型組各組間比較無顯著性差異(P＞0.05),具有可比性。7天、14天、28天頭穴叢刺組、頭穴透刺組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05);頭穴叢刺組與頭穴透刺組在 28天比較有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 各組對腦梗死大鼠腦組織 GAP-43mRNA表達(dá)的影響

表2 各組腦梗死大鼠腦組織GAP-43mRNA表達(dá)的影響比較

見表 2。經(jīng) q檢驗(yàn),組內(nèi)不同時(shí)間窗比較：頭穴叢刺組、頭穴透刺組、模型組在 14天和 7天比較有顯著性差異(P＜0.05),在 28天時(shí)和 14天、7天比較有顯著性差異(P＜0.05);

組間不同時(shí)間段比較：頭穴叢刺組、頭穴透刺組、模型組與假手術(shù)組在 7天、14天、28天比較均有顯著性差異(P＜0.05);頭穴叢刺組、頭穴透刺組分別與模型組在 7天、14天、28天比較均具有顯著性差異(P＜0.05),而頭穴叢刺組與頭穴透刺組在 7天、14天和 28天比較無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

缺血性半暗帶是位于梗死灶外周的缺血組織,是梗死灶周圍的可以逆轉(zhuǎn)的組織,此處的神經(jīng)元生存還是死亡是腦梗死繼續(xù)發(fā)展還是恢復(fù)的關(guān)鍵。腦梗死后神經(jīng)功能缺損可有不同程度的自行改善,長久以來認(rèn)為主要取決于腦組織和血管病變的恢復(fù)過程(側(cè)支循環(huán)的建立、病灶周圍水腫的消退、血腫的吸收、血管的再溝通等),事實(shí)上梗死半影區(qū)殘存腦組織的神經(jīng)可塑性起著重要作用[3]。“神經(jīng)可塑性”是指神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上自身修復(fù)的能力,它是神經(jīng)系統(tǒng)疾病,尤其是腦血管疾病治療和康復(fù)的基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血早期,出現(xiàn) GAP-43陽性表達(dá)減少[4]意味著 GAP-43活性下降,GAP-43的減少被認(rèn)為可影響神經(jīng)纖維的生長、再生及分化,從而抑制了生長錐的形成。神經(jīng)元分化一旦開始,胞體和初生突起中便可見大量的 GAP-43,這顯示出 GAP-43與神經(jīng)發(fā)育密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示：腦組織 GAP-43mRNA的表達(dá)在 7天最高,隨著缺血時(shí)間的延長,腦組織 GAP-43mRNA的表達(dá)逐漸減弱,第 14天表達(dá)降低,第 28天逐漸恢復(fù),這與文獻(xiàn)報(bào)道是相似的。頭穴叢刺組、頭穴透刺組 7天、14天、28天分別與模型組比較,均具有顯著性差異(P＜0.05);說明頭穴叢刺組和頭穴透刺組均可以促進(jìn) GAP-43mRNA的表達(dá),而頭穴叢刺組與頭穴透刺組在 14天和 28天比較無顯著性差異(P＞0.05),表明頭穴叢刺組促進(jìn) GAP-43mRNA的表達(dá)與頭穴透刺組相似。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)頭穴叢刺可增加腦梗死后半暗區(qū)GAP-43mRNA陽性信號的表達(dá)而影響神經(jīng)可塑性,其確切機(jī)制目前尚不清楚,可能同以下因素有關(guān)：①促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長、再生及分化;②軸突長芽、新生突觸及神經(jīng)受損后的修復(fù)影響突觸形態(tài)結(jié)構(gòu);③介導(dǎo)軸突的定向生長,啟動了生長錐的形成,使其向靶組織附著、延伸;④增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量伴隨GAP-43磷酸化的提高。

總之,目前對于腦缺血后 GAP-43基因表達(dá)的變化及其與腦缺血后的神經(jīng)再生的關(guān)系,還知之甚少。但隨著研究的不斷深入,必將逐步揭示腦缺血后 GAP-43基因表達(dá)的變化及其與腦缺血后的神經(jīng)再生的關(guān)系。因此,該研究對于將來在臨床上應(yīng)用新方法促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)再生具有重大的意義。

[1] 劉波,唐強(qiáng),孔妍.頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦梗死患者運(yùn)動功能障礙的臨床研究[J].針灸臨床雜志,2009,25(10)：32

[2] Risedal A,Zeng J,Johansson BB.Early training mayexcerbate brain damage in focal brain ischemia in the rat[J].J Cereb Blood FlowMetab,1999,19(9)：99721003

[3] Johansson BB,Grabowski M.Functional recovery after brain nfarction：plasticity and neural transp lantation[J].Brain Pathol,1994,4(1)：85295

[4] Velazquez RJ,Bell DF,Armstrong PF,et al.Complications of the use of the llizarov technique in the correction of limb deformities in children[J].JboneJointSurg(Am),1993,75：1148