邱細(xì)敏，姜曼花，譚 敏，陸艷艷，楊小紅，馮 星，李麗立

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008； 2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

富貴菜功能成分多糖提取純化工藝優(yōu)化

邱細(xì)敏1，姜曼花1，譚 敏1，陸艷艷1，楊小紅1，馮 星1，李麗立2

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008； 2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

目的：研究富貴菜多糖提取純化工藝，為有效開發(fā)利用功能性食品——富貴菜提供方法學(xué)基礎(chǔ)。方法：通過(guò)正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取方案；采用Sevag法脫蛋白，雙氧水和活性碳脫色，蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量。結(jié)果：在溫度100℃，固液比1:7(富貴菜:水，g/mL)，提取時(shí)間3.5h，提取次數(shù)2次的條件下，所得多糖含量最高。以氯仿:正丁醇的體積比4:1為脫蛋白劑，加入0.15g/mL的活性炭溶液，80℃脫色45min，脫色2次或加入多糖供試液體積70%的雙氧水試液于60℃脫色120min效果最佳。結(jié)論：該工藝條件簡(jiǎn)單可行，多糖提取率高，穩(wěn)定性好，可作為富貴菜多糖的提取純化工藝。

富貴菜；多糖；提取純化工藝；含量測(cè)定

富貴菜[Gynura divaricata(L.)DC.]，別名白子草、白(百)子菜、雞菜、大肥牛、叉花土三七、菊三七、白背菜等，中藥名為富貴菜(或白三七草)，為菊科三七草屬多年生宿根草本植物，分布于臺(tái)灣至華南、西南一帶[1]。喜生長(zhǎng)于村旁、山坡等地，20世紀(jì)90年代中后期逐漸從自然野生發(fā)展為人工栽培，現(xiàn)已被廣大消費(fèi)者所接受，是一種名優(yōu)特保健野菜[2]。食用部位為嫩梢莖、葉，可作湯、涼拌或炒食。富貴菜味淡、性寒，富含多種維生素和礦物質(zhì)，具有降血糖[3]、清熱解毒、止血、涼血等功效。新鮮的富貴菜翠嫩爽口，滾湯方便快捷、營(yíng)養(yǎng)豐富，且可作為夏日清潤(rùn)的湯水。另外可輔助治療急性結(jié)膜炎、小兒高熱、心肺積熱等癥，對(duì)肝熱、煙酒過(guò)多引起的上火作用明顯，對(duì)糖尿病有一定的輔助治療作用[4]。采用適宜的烹制方法，不但可獲得良好的口感，也可取得較好的食療效果。

富貴菜作為一種名優(yōu)特保健野菜，目前對(duì)其研究多見(jiàn)于栽培技術(shù)的改進(jìn)[2,5]。對(duì)其功能性成分的研究極少，化學(xué)活性成分僅見(jiàn)該植物吡咯啶生物堿[6]、黃酮類成分[7-8]及脂肪酸成分分析[9]的報(bào)道，尚未見(jiàn)有關(guān)主要功能性成分之一的多糖提取工藝的研究報(bào)道。多糖

(polysaccharide)是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，多糖在增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發(fā)揮著生物活性作用。本實(shí)驗(yàn)研究富貴菜及功能性成分多糖的提取工藝，旨在為這一野菜資源的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

富貴菜 市購(gòu)。

無(wú)水乙醇、濃硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇(均為分析純)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2501 PC紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取率的測(cè)定

用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量[10]，按照下式計(jì)算多糖提取率。

式中：c為測(cè)定質(zhì)量濃度(用蒽酮-硫酸法測(cè)吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)照所得)；D為稀釋倍數(shù)；V為測(cè)定體積；m為藥材質(zhì)量。

1.2.2 富貴菜多糖的提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

取切碎干燥富貴菜15g，石油醚脫脂后分別進(jìn)行如下不同的單因素試驗(yàn)制得粗多糖。

1)在不同提取溫度條件下，固液比1:9(富貴菜:水，g/mL)，提取2次，每次2h；2)在不同固液比條件下，90℃，提取2次，每次2h；3)90℃，固液比1:9，提取不同次數(shù)，每次2h；4)采用不同提取時(shí)間，90℃，固液比1:9，提取2次。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交水平，即提取時(shí)間、提取溫度、固液比、提取次數(shù)，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳提取條件。

1.2.3 脫蛋白條件優(yōu)化

將粗多糖用適量蒸餾水加熱溶解，加入乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，靜置過(guò)夜，抽濾得淺褐色多糖，按照無(wú)水乙醇→丙酮的順序依次洗滌3遍，至蒸發(fā)皿中，真空冷凍干燥備用。

取上述多糖3份加水溶解，分別加入不同比例除蛋白試劑(氯仿-正丁醇體積比分別為5:1、4:1、3:1)，劇烈振搖10min，靜置分層。除去交界處變性蛋白質(zhì)，重復(fù)處理2次，得脫蛋白處理液，測(cè)定波長(zhǎng)280nm處蛋白吸收峰，比較除蛋白效果，計(jì)算多糖提取率。

1.2.4 脫色條件優(yōu)化

1.2.4.1 活性炭脫色條件優(yōu)化

脫蛋白富貴菜多糖加入乙醇至其終體積分?jǐn)?shù)為75%，靜置過(guò)夜抽濾，按照無(wú)水乙醇→丙酮的順序依次洗滌3遍，真空冷凍干燥。將上述多糖加適量水定容作為富貴菜多糖供試液。取活性炭適量溶解抽濾后，加水配制成不同質(zhì)量濃度的懸浮液，作為活性炭試液。

1)取5份20mL富貴菜多糖供試液，分別加入10mL 0.1g/mL的活性炭試液，并不斷振搖，使活性炭充分分散。分別于40、50、60、70、80℃水浴恒溫30min，過(guò)濾，觀察濾液脫色效果，計(jì)算多糖提取率。2)取4份20mL富貴菜多糖供試液，各加10mL 0.1g/mL的活性炭試液，搖勻后，8 0℃水浴中，分別恒溫1 5、3 0、45、60min后，過(guò)濾，觀察濾液脫色結(jié)果，計(jì)算多糖提取率。3)取4份20mL的富貴菜多糖供試液，各加10mL質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15g/mL和0.20g/mL的活性炭試液，80℃水浴恒溫30min，過(guò)濾，觀察濾液脫色結(jié)果，計(jì)算多糖提取率。4)取4份20mL的富貴菜多糖供試液，各加10mL 0.1g/mL的活性炭試液，80℃水浴恒溫30min，過(guò)濾，濾液分別重復(fù)脫色操作0、1、2、3次，觀察濾液脫色效果，計(jì)算多糖提取率。

1.2.4.2 雙氧水脫色條件優(yōu)化

取脫蛋白多糖加水溶解、定容，作為供試液。取雙氧水配成50%的雙氧水溶液，作為雙氧水試液。

1)取10mL富貴菜多糖供試液5份，各加10mL雙氧水試液，分別于50℃水浴中恒溫1、1.5、2、2.5、3h，觀察脫色效果，計(jì)算多糖提取率。2)取10mL富貴菜多糖供試液4份，各加多糖供試液體積30%、50%、70%、100%(即3、5、7、10mL)的雙氧水試液，在50℃水浴中恒溫2h，觀察脫色效果，計(jì)算多糖提取率。3)取10mL的富貴菜多糖供試液5份，各加10mL 體積分?jǐn)?shù)50%的雙氧水試液分別在40、50、60、70、80℃恒溫2h，觀察脫色效果，計(jì)算多糖提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同溫度對(duì)多糖提取率的影響

表2 不同溫度對(duì)多糖提取率的影響Table 2 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

由表2可知，當(dāng)提取溫度為90℃時(shí)，提取率已達(dá)6.31%，與100℃的提取率差別不大。因此選取90℃為宜。確定正交試驗(yàn)的提取溫度水平為80、90、100℃。2.1.2不同固液比對(duì)多糖提取率的影響

表3 不同固液比對(duì)多糖提取率的影響Table 3 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide yield

由表3可知，當(dāng)固液比為1:9時(shí)，提取率達(dá)到最高為5.32%，且1:7、1:8的提取效果均好于1:10，所以確定正交試驗(yàn)的固液比水平為1:7、1:8、1:9。

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

表4 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Table 4 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由表4可知，當(dāng)提取時(shí)間為3.0h時(shí)，提取率為最高5.80%，所以確定正交試驗(yàn)的提取時(shí)間水平為2、3、3.5h。

2.1.4 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

表5 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Table 5 Effect of extraction times on polysaccharide yield

由表5可知，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，提取率為最高6.33%，所以確定正交試驗(yàn)的提取次數(shù)水平為1、2、3次。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental values of polysaccharide yield and purity

表7 方差分析Table 7 Variations analysis for polysaccharide yield with various extraction conditions

表6、7為富貴菜多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)及方差分析表。方差分析中，定偏差最小的C項(xiàng)為誤差來(lái)源項(xiàng)。由表6、7可知：提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)所得多糖提取率影響較大。在加水浸泡后，固液比對(duì)多糖提取率影響較小。綜合分析得提取最佳條件為A3B1C3D2，即提取溫度溫度100℃，固料比1:7，提取時(shí)間3.5h，提取次數(shù)2次時(shí)，提取效果較好。

2.3 脫蛋白條件優(yōu)化結(jié)果

表8 氯仿-正丁醇比例對(duì)除蛋白效果的影響Table 8 Effect of chloroform/butanol volume ratio on protein removal

由表8可知，氯仿與正丁醇的體積比對(duì)于脫蛋白效果具有一定的影響，隨著正丁醇比例的增高，脫蛋白效果也隨之變佳(通過(guò)紫外圖譜掃描作為依據(jù))，多糖得率降低。

圖1 脫蛋白多糖紫外掃描圖(氯仿:正丁醇＝4:1)Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of crude Gynura divaricata (L.) DC. polysaccharides after the removal of protein

由圖1可知，在波長(zhǎng)260～280nm處無(wú)蛋白吸收峰，表明脫蛋白完全。綜合考慮氯仿:正丁醇體積比為4:1時(shí)脫蛋白效果最佳。

2.4 脫色效果

2.4.1 活性碳脫色

2.4.1.1 不同脫色溫度的脫色效果

表9 脫色溫度與多糖溶液的脫色效果Table 9 Effect of treatment temperature on color removal with activated carbon

由表9可知，隨著脫色溫度升高，多糖顏色明顯改善，但多糖得率降低，綜上選擇80℃為最佳脫色溫度。

2.4.1.2 不同脫色時(shí)間的脫色效果

表10 加熱脫色時(shí)間與多糖溶液的脫色效果Table 10 Effect of heating time on color removal with activated carbon

由表10可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脫色效果變佳，但多糖提取率降低，綜合考慮故選擇脫色時(shí)間為45min。

2.4.1.3 不同活性炭溶液質(zhì)量濃度的脫色效果

由表11可知，活性炭溶液質(zhì)量濃度越大，脫色效果越好，多糖提取率降低，故選擇活性炭溶液質(zhì)量濃度為0.15g/mL為最佳。

表11 活性炭溶液質(zhì)量濃度與多糖溶液的脫色效果Table 11 Effect of activated carbon concentration in aqueous suspension on color removal

2.4.1.4 不同脫色次數(shù)的脫色效果

表12 脫色次數(shù)與多糖溶液的脫色效果Table 12 Effect of treatment times on color removal with activated carbon

表12表明，粗多糖經(jīng)活性炭脫色2次就基本脫色完全了，隨著脫色次數(shù)的增加，多糖提取率明顯降低，故選擇脫色2次為佳。

2.4.2 雙氧水脫色

2.4.2.1 不同脫色時(shí)間的脫色效果

表13 加熱脫色時(shí)間與多糖溶液的脫色效果Table 13 Effect of heating time on color removal with hydrogen peroxide

表13表明，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色效果變好。2h后，脫色效果基本無(wú)明顯變化，加熱時(shí)間對(duì)多糖提取率影響不大，故選擇2 h為宜。

2.4.2.2 不同雙氧水加入量的脫色效果

表14 雙氧水加入量與多糖溶液的脫色效果Table 14 Effect of hydrogen peroxide concentration on color removal

表14表明，雙氧水試液加入量增多，脫色效果變好，多糖提取率無(wú)明顯影響。從試劑成本角度考慮脫

色時(shí)加入多糖供試液體積70%的雙氧水試液即可獲得較好的脫色效果。

2.4.2.3 不同脫色溫度的脫色效果

表15 脫色溫度與多糖溶液的脫色效果Table 15 Effect of heating temperature on color removal with hydrogen peroxide

表1 5表明，溫度增高，脫色效果變佳，多糖提取率無(wú)明顯影響。60℃以后脫色效果變化不明顯。

3 結(jié) 論

3.1 富貴菜多糖提取工藝優(yōu)化

富貴菜多糖提取中，提取溫度、提取次數(shù)是主要影響因素，其次是提取時(shí)間，固液比影響不顯著。因此在提取時(shí)應(yīng)注意控制提取溫度和提取次數(shù)，富貴菜多糖提取擬采用100℃，固料比1:7，提取時(shí)間3.5h，提取次數(shù)2次時(shí)，所得多糖含量最高。該工藝條件簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可行，多糖提取率高，穩(wěn)定性好，可作為該植物活性成分之一——總多糖的提取條件，為有效開發(fā)利用富貴菜提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

3.2 富貴菜多糖脫蛋白、脫色工藝優(yōu)化

氯仿與正丁醇的比例影響脫蛋白效果，增加正丁醇比例，除蛋白效果提高，但多糖提取率降低。綜合考慮除蛋白試劑最佳配比：氯仿:正丁醇體積為4:1。

活性碳脫色：溫度升高、活性炭質(zhì)量濃度增加，脫色次數(shù)增加，多糖脫色效果越好，但同時(shí)多糖提取率降低；隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，脫色效果變佳，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原性多糖易被氧化?；钚蕴棵撋顑?yōu)條件：溫度80℃、脫色45min、活性炭溶液質(zhì)量濃度0.15g/mL、脫色2次。

雙氧水脫色：雙氧水加入量增多，溫度增高，脫色時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)多糖提取率無(wú)明顯影響，脫色效果增加，但時(shí)間增加至2h，溫度增加到60℃后脫色效果趨于穩(wěn)定，溫度進(jìn)一步升高可能引起多糖鏈發(fā)生變化。雙氧水脫色最優(yōu)條件：加入多糖供試液體積70%的雙氧水試液，60℃脫色2h。

3.3 富貴菜的開發(fā)利用

富貴菜適應(yīng)性廣，耐旱、耐寒 、抗病蟲害，產(chǎn)量高，具有特殊香味，脆嫩可口?？山?jīng)簡(jiǎn)單配制、浸制等手段加工成有獨(dú)特風(fēng)味傳統(tǒng)食品或飲品，或配上其他藥材經(jīng)蒸煮、打漿、酶處理、均質(zhì)等工藝流程加工制成能促進(jìn)人體新陳代謝、增強(qiáng)體力、滋補(bǔ)強(qiáng)身、延年益壽的營(yíng)養(yǎng)液飲料；尤其是利用現(xiàn)代分離分析技術(shù)，如本實(shí)驗(yàn)的研究方法，將富貴菜中的生理活性成分提取后作原料或添加劑，用于各種藥品和食品中，可提高科技含量，增加綜合利用價(jià)值。

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Extraction and Purification of Polysaccharides from Gynura divaricata (L.) DC.

QIU Xi-min1，JIANG Man-hua1，TAN Min1，LU Yan-yan1，YANG Xiao-hong1，F(xiàn)ENG Xing1，LI Li-li2
(1.The Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410008, China；2. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

The extraction yield of Gynura divaricata (L.) DC. polysaccharides affected by extraction temperature, time and times and solid/liquid ratio was optimized by single factor and orthogonal array design methods. In addition, the removals of protein by the Sevag method and of color with hydrogen peroxide or activated carbon from the crude polysaccharide extract obtained were investigated. The anthranone-sulphuric acid method was used for polysaccharide determination. Result showed that a maximum polysaccharide yield was achieved through the optimal twice extraction for 3.5 h each time at 100 ℃ at 1:7 solid/ liquid ratio (g/mL). The optimal solvent for the removal of protein was a mixture of chloroform and n-butanol (4:1, V/V). The addition of 0.15 g/mL activated carbon aqueous suspension for twice treatment for 45 min at 80 ℃ or the addition of 70% (V/V) hydrogen peroxide for 120 min treatment at 60 ℃ gave an optimal removal of color. The procedure proved to be simple, feasible, effective and stable so as to be most suitable for the extraction and purification of polysaccharide from Gynura divaricata (L.) DC..

Gynura divaricata (L.) DC.；polysaccharide；extraction and purification；determination

Q539

A

1002-6630(2010)10-0117-05

2009-07-04

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(08jj3024)；長(zhǎng)沙市科技管理局項(xiàng)目(K069062-12)；湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研資助項(xiàng)目(B2007119)

邱細(xì)敏(1954—)，女，教授，本科，主要從事植物多糖分離分析研究。E-mail：qiuximin@tom.com