蘇鳳賢，王曉琴，茍亞峰，樊子豪，杜雙虎，張芬琴,*

(1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程系，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院生態(tài)研究所，甘肅 張掖 734000)

響應(yīng)面分析果膠酶提高人參果出汁率的工藝參數(shù)

蘇鳳賢1,2，王曉琴1,2，茍亞峰1，樊子豪1，杜雙虎1，張芬琴1,2,*

(1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程系，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院生態(tài)研究所，甘肅 張掖 734000)

果膠酶可以促進(jìn)果膠水解，提高水果的出汁率。運(yùn)用響應(yīng)面法和灰色關(guān)聯(lián)分析優(yōu)化果膠酶影響人參果出汁率的工藝參數(shù)，建立相應(yīng)的回歸模型Y= 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2。方差分析結(jié)果表明，酶解時(shí)間、果膠酶用量對人參果出汁率影響顯著(P＜0.05)，而酶解溫度、初始pH值對出汁率無顯著影響(P＞0.05)。多元回歸分析結(jié)果顯示，初始pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間及果膠酶用量與出汁率之間回歸模型擬合程度較好，可用于實(shí)際生產(chǎn)預(yù)測。

果膠酶；出汁率；二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法(RSM)；灰色關(guān)聯(lián)分析

人參果又名香艷茄、香瓜茄、茄瓜，原產(chǎn)南美洲，屬茄科(Solanaceae)類多年生雙子葉草本植物[1]。人參果是一種高營養(yǎng)水果，果肉清香多汁，腹內(nèi)無核，風(fēng)味獨(dú)特，具有高蛋白、低脂肪、低糖等特點(diǎn)，同時(shí)富含多種維生素、氨基酸以及微量元素，尤其富含被稱為“生命火種、抗癌之王”的硒元素。人參果具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、穩(wěn)定血壓、糖尿病、提高免疫功能等功效，是理想的食療保健水果[2-3]。

果膠是由半乳糖醛酸聚合而成的一種高分子化合物，存在于大多數(shù)新鮮水果細(xì)胞壁和胞間層，不溶于水，為內(nèi)部細(xì)胞的支撐物質(zhì)。當(dāng)水果破碎后，果膠和原果膠進(jìn)入果汁中，使果汁變得黏稠，影響過濾澄清。果膠酶是指分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，包括果膠分解酶、果膠脂酶和多聚半乳糖醛酸酶等，其作用是分解植物細(xì)胞壁上的多聚糖類基質(zhì)，使果蔬汁自流量增加[4]，也可以將果膠分解成果膠酸小分子物質(zhì)[5]，或者控制果汁中的浸漬作用、脫去果膠[6]，使榨汁變得更容易，進(jìn)而提高出汁率，有助于過濾。資料表明，人參果成熟果實(shí)含有的果膠物質(zhì)高達(dá)26.7～34.5mg/100g鮮質(zhì)量[7]，這些果膠物質(zhì)的存在嚴(yán)重影響果酒榨汁工藝。本工作利用DPS軟件進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面法和灰色關(guān)聯(lián)分析優(yōu)化果膠酶在人參果酒壓榨工藝中的應(yīng)用條件，目的在于促進(jìn)果膠物質(zhì)水解，提高人參果的出汁率，節(jié)約成本，為后續(xù)進(jìn)行的人參果酒發(fā)酵研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參果：市售，產(chǎn)于甘肅武威張義鎮(zhèn)，果實(shí)長圓形，直徑3～4cm，外表呈黃色并有清晰的棕色紋絡(luò)；蔗糖 市售優(yōu)質(zhì)白砂糖；果膠酶(10000U/g) 武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2型高速組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇金壇市億通電子有限公司；TD5A-WS型低速離心機(jī) 江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司；HH-4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；PHS-3C型酸度計(jì) 江蘇金壇市科興儀器廠；AL204分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

人參果→分選→清洗→打漿→酶解→滅酶→過濾→人參果汁

1.3.2 單因素試驗(yàn)

研究表明，影響果膠酶酶解作用的因素有：p H值、酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量以及底物濃度等。試驗(yàn)選取其中前4個(gè)因素作為考察對象，同時(shí)，為最大限度地保留人參果的原有成分，除考察初始pH值對人參果出汁率的影響時(shí)調(diào)整了人參果漿的pH值外，考察其他幾個(gè)單因素對人參果出汁率的影響時(shí)都選擇在自然pH值及底物濃度下進(jìn)行。

1.3.2.1 初始pH值對人參果出汁率的影響

將人參果漿添加0.3g/kg果膠酶后用檸檬酸分別調(diào)整初始pH值至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，置于40℃恒溫水浴鍋中酶解75min，取出樣品，滅酶(加熱至沸2min，下同)后離心過濾，測定所得人參果汁質(zhì)量，計(jì)算出汁率。

1.3.2.2 酶解溫度對人參果出汁率的影響

將人參果漿添加0.3g/kg果膠酶在自然pH值下分別置于30、35、40、45、50、55℃恒溫水浴鍋中酶解75min，取出樣品，滅酶后離心過濾，測定所得人參果汁質(zhì)量，計(jì)算出汁率。

1.3.2.3 酶解時(shí)間對人參果出汁率的影響

將人參果漿添加0.3g/kg果膠酶在自然pH值下于40℃恒溫水浴鍋中分別酶解45、60、75、90、105、120min，取出樣品，滅酶后離心過濾，測定所得人參果汁質(zhì)量，計(jì)算出汁率。

1.3.2.4 果膠酶用量對人參果出汁率的影響

將人參果漿分別添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/kg果膠酶在自然p H值下置于4 0℃恒溫水浴鍋中酶解75min，取出樣品，滅酶后離心過濾，測定所得人參果汁質(zhì)量，計(jì)算出汁率。

1.3.3 不同因素處理的人參果出汁率優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.3.1 回歸模型設(shè)計(jì)

統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)是一個(gè)可以用于解釋加工過程中各影響參數(shù)之間交互作用以及找出主要因素的強(qiáng)大的工具[8]。響應(yīng)面法(response surface methology，RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采取特定統(tǒng)計(jì)技巧來用于回歸建模、評估試驗(yàn)中各影響因素的作用以及尋找令人滿意的響應(yīng)值的最優(yōu)化條件的一種統(tǒng)計(jì)方法[9]。其中二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)是一種同時(shí)具有正交性和旋轉(zhuǎn)性的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[10-11]，該方法將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理以消除量綱上的差異，編碼值的取值均限制在[－2，2]，在編碼空間中處于完全平等的地位，所以可直接從回歸系數(shù)絕對值的大小看出其對響應(yīng)值影響的大小[12]。因該方法的回歸計(jì)算及統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算復(fù)雜，且變量較多，因此通常采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的方法來實(shí)現(xiàn)[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用DPS軟件對果膠酶初始pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間和果膠酶用量4因素進(jìn)行二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，研究其對人參果出汁率的影響。因素水平編碼及試驗(yàn)方案見表1，試驗(yàn)結(jié)束后再使用該軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析和灰色關(guān)聯(lián)分析。

表1 試驗(yàn)因素水平與編碼表Table 1 Factors and levels in the quadratic rotary combination design

1.3.3.2 灰色關(guān)聯(lián)分析

對于一個(gè)灰色系統(tǒng)進(jìn)行分析研究時(shí)，首先要解決如何從隨機(jī)的時(shí)間序列中找到關(guān)聯(lián)性，計(jì)算關(guān)聯(lián)度，以便為因素判別、優(yōu)勢分析和預(yù)測精度檢驗(yàn)等提供依據(jù)。根據(jù)上述原則，初步選取相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，同時(shí)為消除不同指標(biāo)的量綱(或單位)，使各指標(biāo)間具有可比性，對原始數(shù)據(jù)處理可采用初值化、均值化、標(biāo)準(zhǔn)值化、中值化、區(qū)間化等方法[15]，本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行變換。而在時(shí)刻t=k時(shí)母序列｛X0(k)｝與子序列｛Xi(k)｝的關(guān)聯(lián)系數(shù)L0i(k)可由式(2)計(jì)算：

式中：Δ0i(k)表示k時(shí)刻兩比較序列的絕對差，即Δ0i(k)= X0(k)－Xi(k) (1≤i≤m)；Δjmax和Δjmin分別表示所有比較序列各個(gè)時(shí)刻絕對差中的最大值與最小值，因?yàn)楸容^序列相交，故一般取Δjmin=0；ρ稱為分辨系數(shù)，其意義是削弱最大絕對差數(shù)值太大引起的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性，ρ∈(0,1)，一般情況下可取0.1～0.5。

關(guān)聯(lián)系數(shù)反映兩個(gè)被比較序列在某一時(shí)刻的緊密(靠近)程度。關(guān)聯(lián)度分析實(shí)質(zhì)上是對時(shí)間序列數(shù)據(jù)進(jìn)行幾何關(guān)系比較[16]，用式(3)進(jìn)行計(jì)算：

式中：roi為子序列i與母序列0的關(guān)聯(lián)度；N為比較序列的長度(即數(shù)據(jù)個(gè)數(shù))。

1.3.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化驗(yàn)證果膠酶對人參果出汁率的影響因素

在灰色關(guān)聯(lián)分析及二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以果膠酶初始pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間和果膠酶用量4個(gè)因素作為響應(yīng)因素，以出汁率作為響應(yīng)值(Y)，運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，進(jìn)一步優(yōu)化驗(yàn)證果膠酶對人參果出汁率的影響因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH值對人參果出汁率的影響

圖1 初始pH值對人參果出汁率的影響Fig.1 Effect of initial pH on juice yield

由圖1可知，果膠酶初始pH值不同對人參果出汁率影響不同。隨著初始pH值升高，人參果出汁率呈開口向下的拋物線形狀。當(dāng)pH3.5時(shí)，人參果出汁率達(dá)到最高88%，之后隨pH值升高出汁率迅速下降。這可能是因?yàn)楣z酶的活性受pH值影響，處于最適pH值時(shí)酶的活性最高，而高于或低于此值時(shí)都會導(dǎo)致酶活下降，故選擇pH3.5較為適宜。此結(jié)論比商業(yè)用途果膠酶最活躍的pH值范圍4.5～5.5要低[4]。

2.2 酶解溫度對人參果出汁率的影響

圖2 酶解溫度對人參果出汁率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on juice yield

由圖2可知，人參果出汁率隨果膠酶酶解溫度升高而顯著增加，并于50℃時(shí)達(dá)到最大82.3%，55℃時(shí)出汁率反而下降2.5%。果膠酶作為一種酶類是活細(xì)胞所產(chǎn)生的具有生物催化作用的一類特殊的有機(jī)物質(zhì)，具有一定的最適溫度，在此范圍內(nèi)，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨著溫度的升高，果膠酶的活性也逐漸提高，待達(dá)到最適溫度時(shí)，果膠酶的催化能力最高；但高于最適溫度后，酶的催化能力又迅速下降，并最終完全失去催化能力。因此以50℃作為果膠酶的最適酶解溫度較為適宜。

本實(shí)驗(yàn)找到的酶解溫度最適參數(shù)比Thongsombat等[17]報(bào)道的果膠酶最佳酶解溫度45℃略高，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)實(shí)驗(yàn)所采用酶的種類和純度不同造成；但本試驗(yàn)結(jié)果與杜雙奎等[18]和周家華等[19]所報(bào)道果膠酶最適酶解溫度50℃一致，介于商業(yè)化果膠酶最適宜的活性溫度45～55℃[4]之間。

2.3 酶解時(shí)間對人參果出汁率的影響

圖3 酶解時(shí)間對人參果出汁率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on juice yield

酶解時(shí)間是影響人參果出汁率的重要因素之一，研究表明，二者在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。但是酶解時(shí)間又不能無限制延長，這是因?yàn)殡S著處理時(shí)間的延長，一方面增加了生產(chǎn)企業(yè)的成本，另一方面也有可能在提取過程中造成人參果營養(yǎng)成分的流失。從圖3可知，雖然在酶解105min時(shí)人參果出汁率達(dá)到最高94.3%，可是該值與酶解90min時(shí)93.3%的出汁率相比并無顯著提高，因此，考慮生產(chǎn)成本因素，酶解時(shí)間最終選擇90min。

2.4 果膠酶用量對人參果出汁率的影響

圖4 果膠酶用量對人參果出汁率的影響Fig.4 Effect of enzyme load on juice yield

圖4 可見，人參果出汁率與果膠酶用量之間呈正相關(guān)，當(dāng)果膠酶用量為0.4g/kg時(shí)，人參果出汁率達(dá)到最高94%；而果膠酶用量增加到0.5g/kg時(shí)，人參果出汁率反而下降了0.7%，故本實(shí)驗(yàn)果膠酶的最適用量確定為0.4g/kg，這一結(jié)果比張素霞[20]研究結(jié)果果膠酶最適用量0.36g/kg略高，而與不添加果膠酶相比，人參果出汁率整整提高了16.5%，由此可見，添加果膠酶可以顯著提高果蔬的出汁率。

2.5 不同因素處理的人參果出汁率工藝參數(shù)優(yōu)化

表2 四因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Quadratic rotary combination design layout and experimental results

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用DPS軟件對4個(gè)因素按表1的編碼水平進(jìn)行二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。

2.5.1 灰色關(guān)聯(lián)分析

各處理因素與人參果出汁率的關(guān)聯(lián)系數(shù)及加權(quán)灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 人參果出汁率與各因素的關(guān)聯(lián)序Table3 Correlation coefficients of juice yield with four technological parameters

從表3分析結(jié)果來看，人參果出汁率與果膠酶初始p H值、酶解溫度、酶解時(shí)間、果膠酶用量之間的關(guān)聯(lián)序?yàn)閤3＞ x1＞ x4＞ x2，即人參果出汁率與各處理之間的關(guān)聯(lián)度第一位是果膠酶酶解時(shí)間，其次是人參果初始pH值，再次是果膠酶用量和酶解溫度。

2.5.2 回歸模型的建立

運(yùn)用DPS軟件處理二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，建立不同因素處理的人參果出汁率模擬回歸模型。

出汁率初步回歸方程：

由于各因素對人參果出汁率的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因素的影響大小，需對其進(jìn)一步進(jìn)行多元回歸分析[21]，結(jié)果見表4，并在α=0.05顯著水平剔除回歸方程中不顯著項(xiàng)后，得到簡化后的回歸模型：

從表4的回歸模型方差分析可以看出，影響人參果出汁率的主要因素為x3和x4，即酶解時(shí)間和果膠酶用量，特別是一次項(xiàng)中x3因素和二次項(xiàng)中x32具有極高的顯著性(P＜0.01)。對回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，表明初始pH值和果膠酶酶解溫度的交互作用與人參果出汁率呈負(fù)效應(yīng)，而酶解時(shí)間和果膠酶用量的一次項(xiàng)以及酶解時(shí)間的二次項(xiàng)對人參果出汁率影響為正效應(yīng)。其他變量的影響均不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對表4失擬項(xiàng)作F檢驗(yàn)，F(xiàn)1=1.716＜F0.05(dfLF，dfe)，說明失擬項(xiàng)在0.05水平上不顯著，進(jìn)一步用統(tǒng)計(jì)量F2對回歸方程作F檢驗(yàn)，F(xiàn)2=2.428＞F0.05(dfr，dfs)，說明回歸方程在0.05水平上顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的二次數(shù)學(xué)模型基本上是符合的。二次回歸方程與實(shí)際情況擬合程度較好，可以用于不同處理對人參果出汁率影響的預(yù)測，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

表4 回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance for the established regression model

2.5.3 果膠酶對人參果出汁率影響因素優(yōu)化

固定其他3個(gè)因素于零水平，求第4個(gè)因素與因變量的回歸方程，根據(jù)這些方程得到4個(gè)因素對人參果出汁率影響的關(guān)系曲線，見圖5。

圖5 單因素與出汁率關(guān)系圖Fig.5 Plots of juice yield versus different levels of each technological parameter (three others fixed at zero level)

由圖5可以看出，隨著果膠酶用量增加，人參果出汁率逐漸升高，二者呈線性正相關(guān)；而人參果出汁率與果膠酶酶解時(shí)間卻呈開口向上的拋物線形狀，并于＋2水平處取得極大值；酶解溫度與初始pH值的變化對人參果出汁率無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響；人參果出汁率最高出現(xiàn)在＋2水平處。

固定兩個(gè)因素于零水平，研究其他兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)，用DPS軟件制作出響應(yīng)面圖(圖6)。

圖6 影響人參果出汁率各因素間響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams displaying the pairwise interactive effects of four technological parameters on juice yield

從圖6可以看出，當(dāng)把果膠酶酶解溫度、果膠酶用量固定于零水平或把初始pH值、果膠酶用量固定于零水平時(shí)，初始pH值或酶解溫度變化均未引起人參果出汁率的變化，即二者對出汁率無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響；而隨著酶解時(shí)間的延長，人參果出汁率卻呈開口向上的拋物線形狀，只有在酶解時(shí)間較長的時(shí)候出汁率才取得極大值(圖6a、b)；當(dāng)把初始pH值、酶解溫度固定于零水平時(shí)，隨著酶解時(shí)間延長，出汁率呈開口向上的拋物線，并于酶解時(shí)間處于＋2水平時(shí)取得極大值；果膠酶用量與出汁率呈正相關(guān)，隨著果膠酶用量的增加，出汁率呈緩慢上升趨勢，并于酶解時(shí)間與果膠酶用量均取處于＋2水平時(shí)，出汁率取得極大值(圖6c)。

響應(yīng)面的繪制進(jìn)一步驗(yàn)證了2.5.2節(jié)二次旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)建模及方差分析中所得結(jié)論。

3 結(jié) 論

3.1 通過回歸建模和統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)影響人參果出汁率的各因素間存在多重共線性。因此本研究使用一般的回歸分析并不合適。

3.2 灰色關(guān)聯(lián)分析可對多重共線性樣本數(shù)據(jù)有較好的處理。本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，確認(rèn)果膠酶初始p H值、酶解溫度、酶解時(shí)間、果膠酶用量對人參果出汁率起重要作用；分析結(jié)果顯示關(guān)聯(lián)序與回歸模型基本相符(只有二三位關(guān)聯(lián)序有微弱差別)，說明灰色關(guān)聯(lián)分析可以用于多重共線性數(shù)據(jù)資料的分析處理。

3.3 通過4因素5水平的二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，用DPS軟件進(jìn)行回歸分析和響應(yīng)面分析，建立了人參果出汁率與果膠酶初始pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間、果膠酶用量關(guān)系的回歸模型Y= 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2。從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，不同酶解時(shí)間和果膠酶用量對人參果出汁率影響顯著(P＜0.05)，而初始pH值和酶解溫度對出汁率則無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響(P＞0.05)。方差分析結(jié)果顯示該回歸模型的建立擬合性較好，說明可以將其用于生產(chǎn)預(yù)測，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

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Optimization of Technological Parameters for Pectinase Hydrolysis for Improved Pepino Juice Yield Using Response Surface Analysis

SU Feng-xian1,2，WANG Xiao-qin1,2，GOU Ya-feng1，F(xiàn)AN Zi-hao1，DU Shuang-hu1，ZHANG Fen-qin1,2,*
(1. Department of Life Science and Engineering, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. Institute of Ecology, Hexi University, Zhangye 734000, China)

The optimization of four technological parameters for the pectinase hydrolysis was carried out using response surface and grey correlation analyses in order to improve juice yield. A regression model with juice yield (Y) as a function of initial pH (x1), hydrolysis temperature (x2), hydrolysis time (x3) and enzyme load (x4) was set up as follows: Y = 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2. The analysis of variance for the model showed that hydrolysis time and enzyme load significantly affected juice yield (P＜0.05) and that the others had no significant effect on juice yield (P＞0.05). The multiple regression analysis indicated that the established model had an excellent goodness of fit, suggesting good reliability in predicting the function.

pectinase；juice yield；quadratic rotary combination design；response surface methodology (RSM)；grey correlation analysis

Q814

A

1002-6630(2010)20-0083-06

2010-01-01

蘇鳳賢(1974—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：supeiecho@sina.com

*通信作者：張芬琴(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樯c生物技術(shù)。E-mail：fenqinzh@hxu.edu.cn