王曼知，李嘉，王團美

（長沙市中心醫(yī)院兒科，湖南長沙 410004）

近年來，由于抗生素不合理使用等諸多因素影響致耐藥現(xiàn)象日益嚴重，再加上抗生素研發(fā)困難，耗資大，時間長，因此，尋找新型抗生素及其它抗菌物質(zhì)已成為全球醫(yī)藥界面臨的緊迫問題。人防御素具有強大的抗菌功能，是人體天然免疫機制的重要組成部分，是正常機體抵抗外界病原微生物入侵的重要防線，因此人們把它看作一個對付細菌耐藥的可能突破口而對其投入了極大的關(guān)注。其中，最為引人注目的是人β防御素，它在保護上皮細胞和粘膜免受感染方面起著重要作用[1,2]。與hBD-1在正常人氣道中固有、持續(xù)表達不同，hBD-3受腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細菌刺激時可表達上調(diào)[3,4]。特別是在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中，hBD-3是防御革蘭陰性菌、陽性菌及真菌感染的屏障，且相同濃度的hBD-3比hBD-1、hBD-2的抗菌活性高十倍以上，因此，它在防御呼吸道感染中更有價值。國外有學者對hBD-3在呼吸系統(tǒng)中的作用進行了探索[3,4]。但hBD-3的表達是否與刺激時間長短有關(guān)，目前國內(nèi)外報道很少。因此本研究以LPS為刺激物，采用RT-PCR法檢測人支氣管上皮細胞hBD-3mRNA的表達，觀察LPS刺激不同時間后hBD-3表達量的變化，了解hBD-3表達在刺激后何時起效，持續(xù)的時間多長，能否成為急性時相反應蛋白應用于臨床，為防治呼吸道感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人支氣管上皮細胞 (購自中南大學湘雅醫(yī)學院湘雅細胞中心)。

1.1.2 主要試劑 新生牛血清 (FCS)(杭州四季青公司)，1640(美國GIBCO公司)，LPS(E.colio L2880)及瓊脂糖(sigma公司),Trizol(invitrogen公司)，RT試劑盒(Fermentas公司)，TAG酶及dNTP(tiangen公司)，二乙基焦碳酸酯 (DEPC)(北京鼎國生物技術(shù)公司)，hBD-3引物及陽性對照β-actin引物(上海英駿生物工程技術(shù)服務有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

生長良好人支氣管上皮細胞隨機分為5組，分別為對照組和4個不同濃度LPS組。其中，對照組加入含10%FCS的1640培基5mL，LPS組又分為4組，分別加入含LPS濃度為0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的10%FCS的1640培基5mL，各組均置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng)，分別在誘導1h、2h、4h、8h后行RT-PCR檢測hBD-3mRNA的表達。

1.2.2 RT-PCR檢測hBD-3mRNA的表達

取不同實驗組的支氣管上皮細胞，分別在LPS誘導1h、2h、4h、8h后采用Trizol法抽提RNA。依吸光度值，取等量總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，含1μL隨機引物，2μL dNTP，1μLMMLV,總體積20μL。反應條件為：70℃ 5 min，37℃ 5 min，42℃ 60 min,70℃ 10 min。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用Tag酶，按以下程序進行PCR反應。上游引物為：5′-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′，下游引物為：5′-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3′，產(chǎn)物長206bp。反應條件為：98℃預變性5 min，再經(jīng)94℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s共32個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。同時設(shè)陽性對照β-actin，產(chǎn)物長450bp。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用mean±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行方差分析，相關(guān)分析采用spearman檢驗，圖表繪制采用Excel7.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

生長良好的人支氣管上皮細胞鏡下顯示細胞輪廓清楚，有光澤，易貼壁，生長快，背景干凈，脫落細胞少，2～3天即可長滿并傳代。結(jié)果如圖1、圖2所示。

2.2 LPS刺激LPS刺激后，細胞輪廓不清楚，暗淡無光澤，貼壁細胞易脫落，生長慢，背景模糊。（見圖3、圖4）。

2.3 hBD-3mRNA在對照組人支氣管上皮細胞中的表達發(fā)現(xiàn)hBD-3mRNA在對照組人支氣管上皮細胞中有微量表達，不同時間組間(1h、2h、4h、8h)無顯著性差異(P＞0.05)。（見表1、圖5和圖6） 2.4 LPS誘導人支氣管上皮細胞hBD-3mRNA表達的時效關(guān)系

表1 不同濃度LPS不同時間點hBD-3mRNA的表達(mean±s)(n=8)

人支氣管上皮細胞在被不同濃度LPS(0.01、0.1、1、10μg/mL)誘導不同時間(1h、2h、4h、8h)后，在同一濃度組隨時間增加hBD-3mRNA表達量亦增加，呈時間相關(guān)性，不同時間組間比較有顯著性差異 (P＜0.01)。hBD-3mRNA表達的半定量結(jié)果以hBD-3/β-actin吸光度的相對值計算。（見表1、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12）

3 討論

支氣管上皮細胞覆蓋在整個氣道，是呼吸道與外界病原菌接觸的屏障。細菌感染呼吸道首先要在支氣管上皮細胞上粘附、定植，隨后產(chǎn)生毒素引起損傷。宿主亦調(diào)動自身防御機制，抵抗細菌入侵。宿主的防御機制包括：粘液纖毛系統(tǒng)、吞噬細胞系統(tǒng)、特異性體液免疫系統(tǒng)和先天性防御機制。上皮細胞分泌hBD-3，就是其先天防御機制之一。本實驗以人支氣管上皮細胞為研究對象，選擇多種革蘭陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為誘導物，觀察人支氣管上皮細胞被LPS誘導后的形態(tài)及hBD-3表達強弱的變化，為探索hBD-3能否作為抗菌物質(zhì)使用從而防治呼吸道細菌感染作基礎(chǔ)研究。

實驗發(fā)現(xiàn)，生長良好的人支氣管上皮細胞鏡下顯示細胞輪廓清楚，有光澤，易貼壁，生長快，背景干凈，脫落細胞少，2～3天即可長滿并傳代。LPS刺激后，細胞輪廓不清楚，暗淡無光澤，貼壁細胞易脫落，生長慢，背景模糊。

本實驗中，我們利用不同濃度LPS刺激人支氣管上皮細胞后，通過RT-PCR對刺激不同時間后的細胞中hBD-3的表達水平進行了檢測。發(fā)現(xiàn)在沒有LPS刺激下，人支氣管上皮細胞中的 hBD-3mRNA有微量表達，不同時間點的hBD-3mRNA表達量沒有顯著性差異，推測正常人體內(nèi)支氣管上皮細胞中hBD-3有少量表達，不同時間下表達恒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hBD-3mRNA在LPS刺激后1h即表達增加，推測在細菌侵襲呼吸道后，hBD-3在短時間內(nèi)即可誘導表達，是一個即早應答事件，參與氣道最初的防御反應，有望作為急性時相反應蛋白應用于臨床。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在每一濃度組，隨著LPS刺激時間延長hBD-3mRNA表達也隨之增強，在一定范圍 (1h-8h)內(nèi)具有時間相關(guān)性，表明hBD-3mRNA的誘導表達具有明顯的時效關(guān)系。并且，當細菌存在時間越長，hBD-3被誘導表達越多。說明細菌感染在誘導hBD-3表達中占據(jù)重要地位，一旦機體受到外界病原體入侵時，即可能通過自身防御機制增強hBD-3表達，起到抗感染作用。如細菌感染時間進一步延長，hBD-3mRNA的表達是繼續(xù)增加，還是在一定時間后衰減，尚不得而知，有望我們進一步研究，為探討hBD-3治療的時間窗及藥代動力學打下基礎(chǔ)。

人有兩種免疫應答方式防御病原體入侵：先天和獲得性免疫。hBD-3在先天性免疫中主要是通過直接殺傷病原微生物來完成的。它的抗菌作用機制目前還不是十分清楚，大多數(shù)人認為，抗菌機理和它在微生物胞膜上形成孔道有關(guān)[5，6]。hBD-3還可通過與TLR1和TLR2相互作用，誘導專職抗原遞呈細胞分化，從而增強獲得性免疫[7]。上調(diào)hBD-3可能導致先天性免疫增強，也可能導致獲得性免疫增強，產(chǎn)生直接或間接殺傷作用；上調(diào)hBD-3亦可能導致獲得性免疫反應過激，產(chǎn)生不良后果。因此，隨著研究的深入，有望能通過人工調(diào)控的方式誘導呼吸道內(nèi)源性hBD-3的表達，殺滅病原體，使感染在局部得到有效控制達到防治呼吸道細菌感染的目的。對于某些因體內(nèi)缺乏hBD-3而導致易感性的疾病，如Crohn病[8]，可提供給藥的指針。

[1]Feng Z,Jiang B,Chandra J,et al.Human beta-defensins: differential activity against candidal species and regulation by Candida albicans[J].J Dent Res,2005,84(5):445-450.

[2]Sahly H,Schubert S,Harder J,et al.Burkholderia is highly resistant to human Beta-defensin 3[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(5):1739-1741..

[3]Harder J,Bartels J,Christophers E.Isolation and characterization of human beta-defensin-3,a novel human inducible peptide antibiotic[J].J Biol Chem,2001,276(8): 5707-5713.

[4]Ishimoto H,Mukae H,Date Y,et al.Identification of hBD-3 in respiratory tract and serum:the increase in pneumonia [J].Eur Respir J,2006,27(2):253-260.

[5]Schr?der JM.Epithelial antimicrobial peptides:innate local host response elements[J].Cell Mol Life Sci,199956(1-2): 32-46.

[6]Epand RM,Vogel HJ.Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action[J].Biochim Biophys Acta, 1999,1462(1-2):11-28.

[7]Funderburg N,Lederman MM,Feng Z，et al.Human-defensin-3 activates professional antigen-presenting cells via Toll-like receptors 1 and 2[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(47):18631-18635.

[8]Stange EF,Schmid M,Fellermann K，et al.Chronic inflammatory bowel diseases(IBD):novel pathophysiological concepts and their clinical relevance[J].Praxis(Bern 1994), 2005,94(37):1429-1432.