董偉

(紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南玉溪653100)

煙草底料產(chǎn)品中的低聚糖主要由水蘇糖、棉籽糖和蔗糖3種低分子糖組成,棉子糖又稱蜜三糖,是由半乳糖以α-1,6糖苷鍵與蔗糖的葡萄糖基連接所形成;水蘇糖為四糖,是由棉子糖的半乳糖以α-1,6糖苷鍵與半乳糖連接而成。

目前,低聚糖的測(cè)定方法,以紙層析法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法為主,除液相色譜外,以上方法普遍存在樣品前處理復(fù)雜、靈敏度低、雜質(zhì)干擾大等缺陷。近些年來,高效液相色譜法并配以氨基色譜柱已較為普遍,該法樣品前處理簡(jiǎn)單并能直接測(cè)定,還可減少糖的損失或偶然誤差。但是,樣品中還原糖易與氨基色譜柱中固定相成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而導(dǎo)致色譜柱使用壽命大大縮短,另外,該法使用乙腈配制流動(dòng)相,大大增加了分析測(cè)試成本。作者選用Waters Sugar Pak1鈣型陽(yáng)離子交換色譜柱,以純水作為流動(dòng)相,研究建立了低聚糖的測(cè)定方法,并將其應(yīng)用于煙草底料中蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的分析測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Waters 600高效液相色譜儀,配有Waters600四元輸液泵,2410示差折光檢測(cè)器,7725i進(jìn)樣閥,Empower2色譜工作站;Waters Sugar Pak1鈣型陽(yáng)離子交換色譜柱(6.5 mm×300 mm),Sep-Pak Alumin Cartridges保護(hù)柱;Milli2Q50超純水儀處理后的純水;EDTA鈣鈉:色譜級(jí);蔗糖、棉籽糖、水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)樣品,Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取250 mg水蘇糖、棉籽糖和蔗糖,以純水溶解并定容至10 mL,得到濃度為25 mg/mL的儲(chǔ)備液;然后分別配制成3種組分濃度均為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液 ,4℃冰箱中保存。

1.3 樣品的制備與測(cè)定

準(zhǔn)確稱取煙草底料產(chǎn)品1 g左右至10 mL容量瓶中,加入5 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇,超聲波輔助浸提10 min,以無水乙醇定容至刻度,振搖,取上清液用0.45μm有機(jī)相微孔膜過濾,濾液供 HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

作者選用 Waters Sugar Pak1色譜柱,該色譜柱采用Ca2+型陽(yáng)離子交換樹脂作為填料,該填料使用聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物做骨架,由于高聚物的多孔特性,具有體積排阻的分離機(jī)理,使得樣品中的Ca2+物質(zhì)先被洗脫出來,物質(zhì)后被洗脫出來。此外,Sugar Pak1色譜柱還具有配位交換作用,糖分子端基異構(gòu)碳上所帶羥基可被去質(zhì)子化后帶上強(qiáng)的負(fù)電荷,這些負(fù)電荷與色譜柱的樹脂表面金屬離子Ca2+離子所帶的正電荷之間的相互作用可使糖分子在色譜柱上保留,并在洗脫時(shí)根據(jù)保留性質(zhì)的強(qiáng)弱達(dá)到分離。通過Sugar Pak1色譜柱的雙重分離機(jī)理,可使煙草制品低聚糖樣品的糖組分得到分離,所以該實(shí)驗(yàn)選用Sugar Pak1色譜柱。

2.1 檢測(cè)器的選擇

與紫外可見吸收檢測(cè)器(UVD)相比,示差折光檢測(cè)區(qū)(RID)的靈敏度較低,待測(cè)組分在紫外光區(qū)無特征吸收峰,且待組分在樣品中的含量較高,可選用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

Waters Sugar Pak1鈣型陽(yáng)離子交換柱一般以水作流動(dòng)相,水中加入少量EDTA鈣鈉可減少柱材料上的鈣離子流失,延長(zhǎng)柱的壽命[1];作者考察了流動(dòng)相中加入體積分?jǐn)?shù)5%甲醇、乙腈及四氫呋喃等親水性有機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑對(duì)分離的影響。結(jié)果顯示,加有機(jī)溶劑對(duì)分離并無明顯改善作用,故實(shí)驗(yàn)選用0.05 g/L EDTA鈣鈉水溶液作為流動(dòng)相。

2.3 柱溫的選擇

在室溫(18～25℃)下,低聚糖組分分離度較低,峰型較差,且色譜柱壓力較大,容易損傷色譜柱。實(shí)驗(yàn)表明,柱溫保持在70～90℃之間均可使幾種組分得到較好的分離且色譜柱的壓力較小,本實(shí)驗(yàn)柱溫控制為85℃。

2.4 色譜條件的最終確定

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)最終確定色譜條件。在此色譜條件下將水蘇糖、棉籽糖和蔗糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,得到標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖1。

圖1 棉籽糖、水蘇糖和蔗糖色譜圖Fig.1 Chromatograms of oligosaccharides standard solution

2.5 線性關(guān)系、檢測(cè)限、回收率的考察

以濃度分別為 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品工作液進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)3次,計(jì)算平均值。將3種低聚糖峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,得出相關(guān)系數(shù)r,結(jié)果見表1。圖1為低聚糖混合標(biāo)樣的色譜圖,從中可以看出,3種低聚糖能夠在15min以前全部洗脫出來,并且分離度良好。由表1可見,3種低聚糖的峰面積與其濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系(r>0.99),其中3種糖的相關(guān)系數(shù)都在0.9993～0.9997之間,說明在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;通過分析稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢測(cè)限;樣品平行測(cè)定5次,考察方法精密度。結(jié)果見表1。

樣品通過添加不同質(zhì)量濃度(1.0、3.0、5.0 mg/mL)3種低聚糖混標(biāo)進(jìn)行回收試驗(yàn),基質(zhì)及各加標(biāo)水平樣品平行測(cè)定3份,以外標(biāo)法進(jìn)行定量,并計(jì)算3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率,結(jié)果如圖2及表2所示。3種低聚糖的平均回收率為96.9%～103.5%。

2.6 樣品的測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)建立的提取、分析方法,分別就煙草底料產(chǎn)品中低聚糖含量進(jìn)行了測(cè)定,并計(jì)算出低聚糖的含量,結(jié)果如表3所示。

表1 HPLC法檢測(cè)3種低聚糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.1 Regress equation,r and detection limits of oligosaccharides detected by HPLC

表2 3種低聚糖的回收率測(cè)定Tab.2 Recovery tests for three kinds of oligosaccharides

圖2 煙葉底料樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of tobacco casing materials

表3 低聚糖 HPLC測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of oligosaccharides detected by HPLC

3 結(jié) 語(yǔ)

高效液相色譜法采用Waters Sugar Pak1鈣型陽(yáng)離子交換色譜柱測(cè)定煙草底料產(chǎn)品中低聚糖含量,能使3種低聚糖在15 min內(nèi)良好分離。該法重現(xiàn)性好,靈敏度高,能夠快速測(cè)定煙草底料產(chǎn)品中低聚糖的含量,可推薦用于卷煙加料工序或香精香料品質(zhì)控制工序過程中的常規(guī)分析測(cè)定。

[1]Kolwkar T G,Keskav V S.Determination of Sugars in Sugar Beet with High Performance Liquid Chromatography[J].International Sugar Journal,1998,192(1):164.