卞曙光,姜 鵬,崔玉琳,,劉兆普,秦 松

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋生物學(xué)江蘇省重點實驗室,江蘇 南京 210095; 2.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071; 3.中國科學(xué)院 研究生院,北京 100049)

海洋硅藻是重要的初級生產(chǎn)者,貢獻了地球全部初級生產(chǎn)力的五分之一[1,2]。作為重要的模式藻之一,三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)已完成全基因組測序[3],建立了基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系[4,5],并已應(yīng)用于營養(yǎng)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因的功能驗證[6～9]。在應(yīng)用方面,應(yīng)用光生物反應(yīng)器已建立高密度培養(yǎng)體系[10,11],可用于餌料培育和活性物質(zhì)提取[12,13]。但是,目前在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立三角褐指藻表達系統(tǒng)、高效獲得活性產(chǎn)物方面尚無報道。

篩選轉(zhuǎn)化子是構(gòu)建表達系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟,現(xiàn)有技術(shù)全部應(yīng)用抗生素 Zeocin作為三角褐指藻的篩選試劑[4,5],Zeocin屬于腐草霉素家族,sh ble編碼其抗性基因。但是,Zeocin的價格比較昂貴,通過非特異性剪切DNA從而表現(xiàn)誘變特性[14],且對光敏感容易失效。因此,需建立更安全、廉價的替代篩選方案用于構(gòu)建三角褐指藻表達系統(tǒng)。本文通過比較三角褐指藻對 5種抗生素——氯霉素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、潮霉素和一種除草劑——草丁膦(phosphinothricin,PPT)的敏感性,發(fā)現(xiàn)三角褐指藻對草丁膦非常敏感,并進一步通過導(dǎo)入其抗性基因bar,驗證其篩選效果,以期發(fā)展一種更加安全、高效、經(jīng)濟的篩選體系。

1 材料和方法

1.1 藻株與供體質(zhì)粒

實驗用三角褐指藻藻株(PT-1120)系本實驗室分離保存的克隆材料,以f/2海水培養(yǎng)液培養(yǎng)[15]。供體質(zhì)粒 pSVB系本實驗室構(gòu)建,bar基因上游為 SV40啟動子,下游為其增強子(圖 1),應(yīng)用質(zhì)粒小抽試劑盒(北京博大泰克)進行制備。

1.2 試劑、儀器與耗材

氯霉素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、潮霉素5種抗生素購自青島碧海生物技術(shù)有限公司。抗生素母液配制方法參考文獻[16]。配制的抗生素母液用0.22 μm的濾膜過濾除菌后－20 ℃保存?zhèn)溆?。除草劑草丁膦購自拜耳作物科學(xué)(天津)有限公司; Sourthern雜交所用尼龍膜、地高辛DNA標記和檢測試劑盒購自 Roche公司; 基因槍PDS-1000/He、DNA載片、阻擋網(wǎng)、可裂膜(1500 psi)、鎢粉和DNA轉(zhuǎn)膜儀為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品; 純度為 99.9999%的高壓氦氣購自青島天源氣體制造有限公司; 分子雜交爐為上海新芝生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.3 敏感性實驗

1.3.1 藻株活化與培養(yǎng)

藻種經(jīng)活化后,接種至新鮮的f/2海水培養(yǎng)液中,在20 ℃、12 h/12 h光暗周期、光強1500 lx條件下擴大培養(yǎng)。每隔24 h取樣測A460,并繪制生長曲線。根據(jù)生長曲線,選擇處于對數(shù)生長早期的細胞進行敏感性實驗。

1.3.2 三角褐指藻對抗生素和除草劑的敏感性實驗

取20 mL處于對數(shù)生長早期(A460=0.64,藻細胞濃度約為 5.0×106/mL)的細胞,分別加入不同濃度梯度的抗生素和草丁膦(表1)。每個處理組設(shè)2個重復(fù),并設(shè)置對照組。連續(xù)1周肉眼和顯微鏡明視場和暗視場觀察各處理組的藻細胞生長狀態(tài)。

表1 選擇試劑的濃度設(shè)定Tab.1 Concentrations of selective reagents

1.3.3 三角褐指藻對草丁膦的敏感性實驗

根據(jù)上一步的結(jié)果,重新轉(zhuǎn)接新鮮的三角褐指藻,培養(yǎng)至A460=0.64左右,按0、4、8、16、32、64 mg/L的濃度梯度加入草丁膦進行敏感性實驗。每個處理組設(shè)2個重復(fù),并設(shè)置對照組。每天顯微鏡觀察各處理組的藻細胞生長狀態(tài),并用血球計數(shù)板統(tǒng)計存活情況。

1.3.4 LD50及其95%可信限的確定

采用寇氏法(Karber)計算三角褐指藻對草丁膦的半致死濃度(LD50)及其95%可信限[17]。計算公式如下：

式中,Xm為最大劑量的對數(shù)值;i為相鄰劑量比值的對數(shù); ∑P為各實驗組藻細胞死亡率的總和(以小數(shù)表示)。

式中,N為 LD50的 95%可信限;SlgLD50=i[∑pq/n]1/2,p為一個組的死亡率,q為一個組的存活率,n為每次統(tǒng)計藻細胞總數(shù)。

1.3.5 對LD50差異的顯著性檢驗

按兩個一對分別檢驗相鄰處理時間段的LD50差異的顯著性?？赏ㄟ^計算Ki,j和fi,j二者比值的大小來比較差異是否顯著,如果Ki,j大于fi,j(即Ki,j/fi,j＞1)則兩個LD50有顯著差異。其中：

f為LD50的95%可信限因子(可信限兩端的值分別為 LD50×f和 LD50/f);

1.4 基因槍轉(zhuǎn)化、草丁膦篩選與檢測

1.4.1 受體藻細胞的制備

取20 mL處于對數(shù)生長早期(A460=0.64)的三角褐指藻細胞,5 000 g×10 min離心收集、去上清后,吹打均勻涂布于 f/2固體平板中央。每次轟擊約用1.0×108個藻細胞。

1.4.2 基因槍轉(zhuǎn)化

微粒子彈制備參照Jiang等[18]方法,基因槍轉(zhuǎn)化全過程在超凈工作臺內(nèi)進行。實驗組采用質(zhì)粒pSVB包裹的鎢粉轟擊涂布于平板上的三角褐指藻,陰性對照組采用未經(jīng)質(zhì)粒包裹的裸鎢粉轟擊。轉(zhuǎn)化參數(shù)為：鎢粉直徑1.1 μm,基因槍樣品室真空度為27英寸汞柱,1 500 psi可裂膜,轟擊距離6 cm[4,5]。

1.4.3 草丁膦篩選

基因槍轟擊后暗培養(yǎng) 24 h,然后重懸于 15 mL f/2 海水培養(yǎng)液中,按照 1.3.1的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),并在1周內(nèi)將草丁膦的濃度逐步加至44 mg/L進行篩選。篩選持續(xù)約2～3周,加入草丁膦的培養(yǎng)液每周更換1次。篩選結(jié)束后,離心收集細胞轉(zhuǎn)入新鮮f/2海水培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)30～50 d。

1.4.4 PCR檢測bar基因

將細胞離心收集,應(yīng)用植物基因組小量提取試劑盒(北京天根)提取基因組總DNA。以PCR方法擴增bar基因片段,引物序列及PCR反應(yīng)程序參照Tan等[19]方法,預(yù)期擴增片段為427 bp。

1.4.5 Southern blotting分析

以HindⅢ酶切pSVB質(zhì)粒,回收bar完整基因片段,以隨機引物法用地高辛標記制備雜交探針。DNA的轉(zhuǎn)膜和Southern blotting檢測參照Roche公司的地高辛DNA標記和檢測試劑盒使用說明進行。

2 結(jié)果

2.1 三角褐指藻對抗生素和除草劑的敏感性實驗

對5種抗生素和1種除草劑的敏感性實驗結(jié)果顯示,三角褐指藻對草丁膦最敏感,其次是氯霉素,對氨芐青霉素也有一定的敏感性,而對卡那霉素、潮霉素和鏈霉素完全不敏感。

在草丁膦各劑量組,加入 4h后,培養(yǎng)液均逐漸呈現(xiàn)亮黃綠色,鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞體積變大、顏色變淺,推測胞內(nèi)色素已向外釋放。隨時間延長,這種現(xiàn)象更加明顯,且形態(tài)完整的細胞數(shù)量顯著減少。氯霉素200 mg/L、300 mg/L處理組24 h 后培養(yǎng)液開始呈現(xiàn)黃綠色,顯微鏡下亦能看到少量細胞體積變大。但在培養(yǎng)72～96 h 后,細胞數(shù)目逐漸增多。氨芐青霉素300 mg/L處理組 24 h 后可觀察到部分細胞體積變大,但培養(yǎng)液沒有顏色變化。而卡那霉素、潮霉素和鏈霉素處理組未觀察到變化。所有 5種抗生素處理組 96 h 后細胞狀態(tài)好轉(zhuǎn),細胞數(shù)目開始增多,推測是在低敏感性抗生素壓力下,耐性(而非抗性)藻細胞表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。

2.2 三角褐指藻對草丁膦的敏感性實驗

用細胞計數(shù)法詳細跟蹤記錄了草丁膦對三角褐指藻的生長抑制情況及致死情況(圖2)。加入草丁膦48 h內(nèi),8、16、32、64 mg/L濃度梯度草丁膦實驗組存活的藻細胞數(shù)目迅速下降,并且顯微鏡下視野中有許多細胞解體產(chǎn)生的碎片和顆粒。熒光視野觀察發(fā)現(xiàn)胞外有許多零碎的熒光點,說明葉綠素已經(jīng)釋放。在本實驗的培養(yǎng)條件下,低濃度(16 mg/L以下)草丁膦實驗組 1周內(nèi)藻細胞沒有完全死亡,只有部分細胞被殺死,其他細胞生長受到抑制; 而高濃度(64 mg/L)草丁膦的實驗組,細胞死亡及解體速度很快,1周后已基本無完整形態(tài)的細胞。

圖2 不同濃度的草丁膦對三角褐指藻的致死情況Fig.2 The time-dependent lethal effects of different concentrations of PPT on Phaeodactylum tricornutum

2.3 統(tǒng)計分析

采用寇氏法(Karber)計算出草丁膦對三角褐指藻處理 1周內(nèi)的半致死濃度(LD50)及其 95%可信限(圖3)。對LD50差異的顯著性分析結(jié)果表明,在草丁膦的有效作用期內(nèi),不同時間段的 LD50差異顯著,72 h后的差異最為顯著,LD50從72 h的22.09 mg/L迅速降為 96 h的 16.80 mg/L和 120 h的 13.89 mg/L(表 2)。

圖3 草丁膦處理1周內(nèi)的半致死濃度(LD50)及95%可信限Fig.3 LD50 values and 95% confidence ranges of PPT at different treatment durations

表2 不同時間段內(nèi)LD50的95%可信限統(tǒng)計及差異的顯著性分析Tab.2 Significance analyse of LD50 95% confidence range at different states

2.4 轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的篩選

轉(zhuǎn)化后經(jīng)24 h暗培養(yǎng),各組中加入44 mg/L的草丁膦進行篩選。24 h內(nèi)即發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃綠色,推測藻細胞大量死亡解體并釋放色素。約兩周后,培養(yǎng)液逐漸清亮,并有死亡細胞殘骸沉淀。繼續(xù)培養(yǎng)2周,實驗組培養(yǎng)液逐漸呈現(xiàn)淺褐色,鏡檢有陽性轉(zhuǎn)化子增殖,而對照組無顏色變化(圖4)。

圖4 草丁膦篩選的轉(zhuǎn)基因三角褐指藻Fig.4 The transformed P.tricornutum screened by PPT

2.5 轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的分子檢測

PCR檢測結(jié)果顯示,實驗組在427 bp左右出現(xiàn)特異性條帶,而未轟擊對照組沒有擴增條帶(圖 5)。標記bar基因探針,PCR-Southern blotting也顯示陽性結(jié)果(圖6)。

圖5 PCR擴增檢測bar基因Fig.5 PCR amplification of bar gene

圖6 轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的PCR-Sourthern Blotting檢測Fig.6 PCR-Sourthern blot analysis of transformed P.tricornutum

3 討論

結(jié)果表明,高濃度劑量(300 mg/L)的氯霉素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、潮霉素對三角褐指藻仍不致死,因此上述幾種抗生素不適合在篩選轉(zhuǎn)化子中作為三角褐指藻的篩選壓力,提示可作為殺菌劑使用。90 mg/L的草丁膦處理5 d后,幾乎所有細胞都解體或空化,用統(tǒng)計學(xué)分析法得出了其72 h半致死質(zhì)量濃度為 22 mg/L,與抗生素的作用效果對比,除草劑草丁膦是三角褐指藻理想的篩選試劑。

草丁膦也被稱為 PPT(phosphinothricin,膦絲菌素),是非選擇性廣譜除草劑BASTA的活性成分,是植物體內(nèi)的谷氨酰胺合成酶(GS)的競爭性抑制劑。bar基因編碼乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶,催化乙酰輔酶A與草丁膦的游離氨基結(jié)合,使其失活,從而解除草丁膦對GS的競爭性抑制作用。草丁膦是目前植物基因工程中常用的選擇試劑[20],近年來在藻類中也證明普遍有效[19,21],大型褐藻如海帶、裙帶菜的孢子體[22,23]、配子體[24,25],單細胞綠藻如雨生紅球藻[26]、杜氏鹽藻等[19]都對草丁膦極其敏感,提示藻類對草丁膦的敏感性具有普遍性。

三角褐指藻具有硅質(zhì)細胞壁,通常的轉(zhuǎn)化方法難以突破這一屏障?；驑屧诟邏簹怏w的驅(qū)動下,能使包裹外源DNA的微粒子彈在瞬間實現(xiàn)穿壁,而被導(dǎo)入到藻細胞內(nèi)。通過分子檢測手段證明,在陽性轉(zhuǎn)化子中,外源DNA已經(jīng)整合到受體藻細胞的基因組染色體上。

已有研究表明,Zeocin是三角褐指藻比較敏感的少數(shù)抗生素之一,有效濃度為100 mg/L[4]。在本實驗中,草丁膦對三角褐指藻的最小致死濃度為44 mg/L,具有比 Zeocin更高的敏感性,尤其是,草丁膦成本相對低廉,作用時效長,屬于生物除草劑,高效無毒,因此更適合用于構(gòu)建安全、高效的三角褐指藻外源基因表達系統(tǒng)。

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