孟 鵬,戰(zhàn)文斌,繩秀珍

(中國(guó)海洋大學(xué) 教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

已有報(bào)道哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)能引起海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖高體[1]、尖吻鱸[2]和鱸魚(yú)[3]的潰瘍病,但尚未見(jiàn)哈維氏弧菌引起黑患潰瘍、瞎眼癥的報(bào)道。2008年10月,山東威海網(wǎng)箱養(yǎng)殖黑發(fā)病,主要癥狀為潰瘍、瞎眼,發(fā)病黑體長(zhǎng) 15～20 cm,死亡率約為 30%。為了深入了解該疾病從而采取有效防治措施,作者對(duì)患病黑進(jìn)行了病灶處致病菌的分離,在常規(guī)生理生化鑒定的基礎(chǔ)上,利用基因序列分析的方法對(duì)其進(jìn)行了分類(lèi)鑒定,并進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn),以期對(duì)該疾病的預(yù)防控制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

取體表潰爛嚴(yán)重的瀕死病魚(yú),無(wú)菌條件下從體表、眼睛等部位分離細(xì)菌,劃線接種于2216E、BHI、TSA平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)18～24 h,挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 人工感染實(shí)驗(yàn)

將純化的 3株優(yōu)勢(shì)菌 28℃培養(yǎng) 18～24 h后用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗脫得菌懸液,用McFarland比濁法配制成9×108CFU/mL。并以10倍系列稀釋菌懸液至濃度為 9×107、9×106、9×105和 9×104CFU/mL。

1.3 細(xì)菌鑒定

將分離純化的 HV0811和人工感染后分離純化的HV0811-1劃線接種于2216E和TCBS平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)18 h后觀察菌落特征,同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色和電鏡觀察。

菌株 HV0811、HV0811-1的生理生化特征實(shí)驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》(第九版)[5]進(jìn)行,快速鑒定采用法國(guó)生物梅里埃公司miniATB鑒定系統(tǒng)ID32E鑒定條。

1.4 16S rRNA和HSP60基因序列的測(cè)定和分析

DNA模板制備：菌株HV0811于2216E平板培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h。挑取單一菌落懸浮于無(wú)菌去離子水中,100℃水浴5 min,冷卻后4℃ 12 000r/ min離心10 min,上清液作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

基因序列的 PCR擴(kuò)增與測(cè)序：用于 16S rRNA基因 PCR 擴(kuò)增的引物為正向：27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A) TGGCTCAG-3′(對(duì)應(yīng)于E.coli16S rRNA基因的第 8～27 個(gè)堿基位置),反向：1 492R：5′-TACGG(C/T) TACCTTGTTACTT - 3′ (對(duì)應(yīng)于E.coli16S rRNA基因的第1 492～1 510個(gè)堿基位置); 用于HSP60 基因 PCR 擴(kuò)增的引物為正向：P1：5′-ACAACAGCAACGGTACTAGC-3′,反向：P2：5′-CAACTTTCACGATGCCAC-3′[6]。在 50 μL PCR 反應(yīng)體系中含有：5 μL 10×PCR 緩沖液,3 μL 25 mmol/ L MgCl2,1 μL 10 mmol/ L 4×dNTP,引物各1 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1 μL,模板 DNA 5 μL。16S rRNA 和HSP60基因PCR反應(yīng)條件分別為：94 ℃預(yù)變性4 min,接94℃變性30 s,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸100 s,30個(gè)循環(huán),最后72℃溫育6 min; 94℃預(yù)變性2 min,接著94℃30 s,50℃45 s,72℃ 60 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定特異條帶后,由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定。

序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：菌株 HV0811的16S rRNA和HSP60基因序列已經(jīng)提交國(guó)際互聯(lián)網(wǎng) Gen-Bank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò) Blast與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較,從中選取與所分析的基因序列同源性高的已知菌株,采用ClustalX1.8軟件進(jìn)行多序列匹配排列,用 Mega2.1采用鄰位相連(Neighbor-joining method)獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),通過(guò)自舉分析(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè),自舉數(shù)集1 000次。

1.5 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

藥敏紙片購(gòu)自青島愛(ài)普科生物有限公司,共 30種抗菌藥物,藥敏試驗(yàn)參照紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

圖1 人工感染黑的實(shí)驗(yàn)照片(箭頭示病灶處)Fig.1 Sebastodes fuscescens in the artificial infection experiment(arrows point to the lesions)

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離和人工感染實(shí)驗(yàn)

分離到的優(yōu)勢(shì)菌株分別編號(hào)為 HV0811、PT0811、JH0811,人工感染3～5 d后,菌株HV0811較高濃度感染組的魚(yú)活動(dòng)減弱,從注射部位到尾鰭逐漸潰瘍,體表潰爛出血,眼睛渾濁不透明,尾鰭潰爛,露出尾椎骨,尾柄表皮充血,肛門(mén)紅腫,伴有血樣物流出(圖1),與自然發(fā)病癥狀相同。菌株P(guān)T0811、JH0811組與對(duì)照組未出現(xiàn)任何癥狀。HV0811高濃度組死亡率較高,死亡速度較快; 低濃度組陸續(xù)發(fā)病死亡。用感染發(fā)病魚(yú)的潰爛處、眼球及斷尾分離到的細(xì)菌再次感染黑,得到相同的結(jié)果,證明HV0811是黑潰瘍、瞎眼癥的致病菌。按改進(jìn)的寇氏法[7]計(jì)算菌株HV0811的半致死量為L(zhǎng)D50=7.15×105CFU/尾,表明該菌株具有高致病力,對(duì)黑的感染力較強(qiáng),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 人工感染一周實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of artificial infection experiment for a week

2.2 細(xì)菌鑒定

在 2216E平板培養(yǎng)基上 28℃培養(yǎng) 24 h,菌株HV0811、HV0811-1呈光滑、圓形、濕潤(rùn)、隆起、灰白色的菌落,直徑 1～3 mm; 革蘭氏染色為陰性,短桿菌,多呈單個(gè)排列; 無(wú)芽孢,無(wú)莢膜,有運(yùn)動(dòng)性,不發(fā)光; 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈短桿狀,具有1根端生鞭毛(圖2)。在 TCBS平板培養(yǎng)基上菌落綠色,菌株需Na+生長(zhǎng),低于4℃和高于42℃不生長(zhǎng)。氧化酶、接觸酶、硝酸還原反應(yīng)均為陽(yáng)性,具有賴(lài)氨酸脫羧酶,不具有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、脲酶,發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,利用麥芽糖、甘露糖、海藻糖,不利用半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖。菌株HV0811、HV0811-1生理生化特性見(jiàn)表2。

2.3 16S rRNA和HSP60基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

以總DNA為模板,經(jīng)通用引物27F和1492R擴(kuò)增到HV0811的16S rRNA基因序列條帶約為1 500 bp,經(jīng)引物P1和P2擴(kuò)增到HSP60基因序列條帶約為100 bp和500 bp (圖3),分別選取1 500 bp和500 bp的條帶測(cè)序。不包括引物結(jié)合區(qū),所擴(kuò)增的 16S rRNA 、HSP60基因序列長(zhǎng)度分別為1 033 bp、521 bp。基于 16S rRNA和 HSP60基因序列,采用ClustalX1.8以及 Mega2.1軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明：菌株 HV0811分別與哈維氏弧菌(AY750578)和(AY332571)相類(lèi)聚,其中16S rRNA基因序列與哈維氏弧菌(AY750578)聚合置信度較低,僅有10%(圖4),不能有效地確定該種; HSP60基因序列與哈維氏弧菌(AY332571) 聚為一個(gè)分支的置信度達(dá)100%(圖5)。綜合該菌的形態(tài)、生理生化及 HSP60基因序列比對(duì)結(jié)果,將病原菌HV0811鑒定為哈維氏弧菌。

圖2 菌株HV0811的負(fù)染電鏡照片F(xiàn)ig.2 The electron micrograph of strain HV0811 with negative staining

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

作者對(duì)分離的病原菌Vibrio harveyi進(jìn)行了 30種常見(jiàn)抗菌藥物的敏感性測(cè)定,結(jié)果顯示病原菌對(duì)慶大霉素、新霉素、紅霉素、美滿(mǎn)霉素、氯霉素、先鋒必素、氟哌酸、丙氟哌酸、菌必治、復(fù)達(dá)欣、奧復(fù)星、頭孢呋肟及復(fù)方新諾明高度敏感,對(duì)卡那霉素、丁胺卡那霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、先鋒霉素Ⅴ及呋喃唑酮中度敏感,對(duì)氨芐青霉素、苯唑青霉素、羧芐青霉素、氧哌嗪青霉素、青霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素B、氯潔霉素、先鋒霉素Ⅳ及先鋒霉素Ⅵ耐藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

哈維氏弧菌是海水魚(yú)的常見(jiàn)致病菌,能引起花鱸[8]、斜帶石斑魚(yú)[9～11]、大黃魚(yú)[12]等魚(yú)類(lèi)不同程度的體表潰瘍,充血癥狀。本文中患病黑不僅具有潰瘍的癥狀同時(shí)具有瞎眼癥,角膜不透明、眼球突出,與Saeed等[13]曾報(bào)道的患病的養(yǎng)殖遮目魚(yú)癥狀相同。作者認(rèn)為哈維氏弧菌在導(dǎo)致黑出現(xiàn)以潰瘍?yōu)橹鞯?/p>

表2 菌株HV0811、HV0811-1、哈維氏弧菌《伯杰氏手冊(cè)》第九版的生理生化特征比較Tab.2 Comparisons of physiological and biochemical characteristics of HV0811、HV0811-1 and Vibrio harveyi

圖3 菌株HV0811的16S rRNA和HSP60基因的PCR擴(kuò)增未純化產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification products of 16S rRNA and HSP60 genes of strain HV0811

圖4 以16S rRNA基因構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Vibrio based on 16S rRNA gene

本實(shí)驗(yàn)分離的哈維氏弧菌HV0811在TCBS上生長(zhǎng)呈綠色與相關(guān)文獻(xiàn)[9～10]報(bào)道的黃色結(jié)果不一致,原因在于 TCBS的成分中包含蔗糖,相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的哈維氏弧菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸,而本實(shí)驗(yàn)分離的哈維氏弧菌不發(fā)酵蔗糖,若在 TCBS培養(yǎng)基中加入葡萄糖,生長(zhǎng)結(jié)果則變?yōu)辄S色,此差異的主要原因可能是種類(lèi)個(gè)體之間存在差異性。

圖5 以HSP60基因構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of Vibrio based on HSP60 gene

表3 菌株HV0811對(duì)不同抗菌藥物的敏感性Tab.3 Sensitivity of strain HV0811 to antibacterial agents

從16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上看,節(jié)點(diǎn)的置信度普遍很低,其中菌株 HV0811與哈維氏弧菌(AY750578)聚合的置信度僅有10%,由于弧菌屬16S rRNA基因序列的種間差異不顯著,導(dǎo)致弧菌不具有唯一的聚類(lèi)特征[15]。以 HSP60基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù),置信度普遍明顯高于16S rRNA基因,作者認(rèn)為16S rRNA基因序列同源性分析不適宜用于親緣關(guān)系較近的弧菌種之間的鑒別,而HSP60基因比16S rRNA基因攜帶更多的多態(tài)信息,因此 HSP60基因比 16S rRNA基因更適合于海水養(yǎng)殖動(dòng)物中弧菌的分類(lèi)研究,這與吳淑勤等[10]觀點(diǎn)相同。作者采用的 HSP60基因序列分析和生理生化鑒定方法都證明分離的病原菌HV0811屬于弧菌屬的哈維氏弧菌。

[1]吳后波,潘金培.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖高體弧菌病致病菌研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1997,21(2)：171-174.

[2]Cop land J W,Grey D L.Management of wild and cultured sea bass barramundi (Lates calcarifer Bloch)[A].Proceeding of an international work shop help at Draw in N T,Australia[C],AC：IAR Proceedings,1987.20.

[3]王國(guó)良,金珊,薛良義,等.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚(yú)皮膚潰瘍病及其病原菌的研究[J].渤海海洋,2000,18(3)：01-06.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001.

[5]Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition [M].Maryland：Williams & Wilkins,1994.

[6]張偉妮,周麗,邢婧,等.養(yǎng)殖大菱鲆腹水癥病原菌SR1的分離及鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2006,13(4)：603-609.

[7]鄒玉霞,張培軍,莫照蘭,等.大菱鲆出血癥病原菌的分離和鑒定[J].高技術(shù)通訊,2004,4(4)：89-93.

[8]王保坤,余俊紅,李筠,等.花鱸弧菌病病原菌(哈維氏弧菌)的分離與鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2002,9(1)：52-55.

[9]陳獻(xiàn)稿,吳淑勤,石存斌,等.斜帶石斑魚(yú)病原菌(哈維氏弧菌)的分離與鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2004,11：313-317.

[10]李寧求,白俊杰,吳淑勤,等.斜帶石斑魚(yú) 3種致病弧菌的分子生物學(xué)鑒定[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(3)：356-361.

[11]覃映雪,池信才,蘇永全,等.網(wǎng)箱養(yǎng)殖青石斑魚(yú)的潰瘍病病原[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2004,28(3)：297-302.

[12]毛芝娟,劉國(guó)勇,陳昌福.大黃魚(yú)潰瘍病致病菌的初步分離與鑒定.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)[J],2002,29(2)：178-181.

[13]Saeed M O.Association ofVibrio harveyiwith mortalities in cultured marine fish in Kuwait [J].Aquaculture,1995,136：21-29.

[14]郝貴杰,沈錦玉,潘曉義,等.32種常用漁藥對(duì)大黃魚(yú)致病菌哈維氏弧菌的體外抗菌試驗(yàn).中國(guó)獸藥雜志[J],2008,42(5)：36-39.

[15]Kim Y B,Okuda J,Matsumoto C,et al.Identification ofVibrio Parahaemolyticusstrains at the species level by PCR targeted to thetoxRgene[J].J Clin Microbiol,1999,37( 1)：173-177.