王 瑜,雷連成,韓文瑜,謝 芳,李林溪,周 靚,楊舒心,胡本鋼,邢艷蘋,計(jì) 群,路 榮,劉曉賀,何伯萍

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎的病原菌。豬傳染性胸膜肺炎是一種高度傳染性和致死性的呼吸系統(tǒng)疾病,它主要經(jīng)呼吸道感染并且具有專一性的侵害豬的肺臟。所以,在該菌的定植過(guò)程中,黏附成為該菌感染不可缺少的生存定居的過(guò)程[1]。2002年,Ingrid Van Overbeke等[2]研究發(fā)現(xiàn),APP黏附于宿主細(xì)胞的過(guò)程可能是由多因素多因子共同參與完成的。而目前有關(guān) APP黏附作用的研究寥寥無(wú)幾,僅有脂多糖(LPS)、菌毛等[3～5]。由此推測(cè),含有一些潛在的黏附因子尚未被發(fā)現(xiàn),有待進(jìn)一步研究。

吉林大學(xué)和平校區(qū)畜牧獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室在前期研究中,首次發(fā)現(xiàn) APP存在三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素[6],并發(fā)現(xiàn)其在不同血清型中的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素存在著顯著的差異,其中血清 5b型具有完整的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的結(jié)構(gòu)。但是,目前對(duì)于該蛋白的黏附功能尚不明確。筆者在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,將首次獲得的 APP血清 8型基因序列與APP血清 3,5b,7型進(jìn)行對(duì)比,以及基因序列進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株

胸膜肺炎放線桿菌(APP)血清 8型 CVCC 405菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC);大腸桿菌 DH5α菌株購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試劑

腦心浸液(Brain Heart Infusion,BHI)、馬血清、NAD(sigma)等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物試劑公司;AxyPrep BacterialGenomic DNA Miniprep kit(Axygen),QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN),DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)等試劑盒分別購(gòu)自長(zhǎng)春維特潔、長(zhǎng)春聯(lián)星生物公司、長(zhǎng)春科隆生物工程用品經(jīng)銷部;限制性內(nèi)切酶 SalⅠ,EcorⅠ,La Taq,dNTP(TaKaRa)等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基按文獻(xiàn)介紹的方法配制[15],高壓滅菌,待溫度降到約 50℃時(shí),加入 1/200的 NAD,質(zhì)量濃度為 50 g/L的小牛血清,搖勻,倒平皿,4℃保存。

1.4 基因組 DNA的提取

APP菌株血清 8型 CVCC405接種于 2m L BHI液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng) 12 h,10 000 r/min,離心3 min,收集菌體。采用 AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep kit(Axygen)提取基因組,具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書,質(zhì)量濃度為 7 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 PCR擴(kuò)增條件

通過(guò) APP血清 5b(L20)型的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 N端 3 875 bp設(shè)計(jì)引物,以 APP血清 8型 CVCC 405為模板,擴(kuò)增序列。PCR擴(kuò)增體系:5 L 10×La Taq Buffer,5μL dNTPMixture(2.5mmol/each),1μL Primer(上)(50μmol/L),1μL Primer(下)(50μmol/L),2μL APP血清 8型基因組,0.5μL La Taq(5×106U/L),dd H2O補(bǔ)至 50μL。

PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性 5min;94℃1m in,50℃ 2m in,72℃4min,進(jìn)行 30個(gè)循環(huán),最后 72℃10 min。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為 10 g/L的瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 PCR產(chǎn)物的回收

采用AxyPrep DNAGel Extraction kit(Axygen)對(duì)PCR擴(kuò)增的目的片斷進(jìn)行回收,具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.7 克隆與測(cè)序

將回收的 PCR產(chǎn)物連接到 pMD18-T載體上按資料介紹的方法[7]連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α,經(jīng)氨芐抗性篩選得到陽(yáng)性克隆,酶切鑒定,對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.8 序列比對(duì)分析

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件將獲得的 APP血清 8型核酸序列進(jìn)行分析,應(yīng)用 DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對(duì)及同源性分析,結(jié)果用于系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.9 APP血清 8型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的生物信息學(xué)分析

1.9.1 SMART軟件在線分析 使用在線分析軟件 SMART(http://SMART.embl-heidelberg.de)對(duì)測(cè)序后推斷的 APP血清 8型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的編碼蛋白進(jìn)行分析;同時(shí)對(duì) Genbank報(bào)道的 APP血清 5b型和7型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素序列(登錄號(hào):CP000569.1和 CP001091.1)進(jìn)行分析。

1.9.2 信號(hào)肽分析 使用信號(hào)肽分析軟件 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽。

1.9.3 黏附功能區(qū)的預(yù)測(cè) 使用生物信息學(xué)軟件 SMART(http://SMART.embl-heidelberg.de)和自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分析軟件 daTAA(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/dataa)對(duì)黏附基序進(jìn)行分析,并預(yù)測(cè)黏附的重要功能區(qū)域。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的引物對(duì) APP血清 8型基因組進(jìn)行擴(kuò)增,得到約 3 000 bp的特異性條帶(圖 1)。

2.2 序列測(cè)定

圖 1 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖 APP血清 8型,

通過(guò) DNAStar軟件分析,表明序列長(zhǎng)度為 3 366 bp,與血清 5b型相比缺失了 509 bp的氨基酸。該基因編碼 1 122個(gè)氨基酸。

2.3 序列分析

使用 DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序得到的 APP血清 8型核苷酸序列與 GenBank中已知的 3,5b,7核苷酸序列進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示序列的一致性為 77.2%,核苷酸序列存在著差異(表 1)。

表 1 不同血清型的APP序列比對(duì)

通過(guò) DNAstar軟件對(duì)測(cè)序得到的序列分析,發(fā)現(xiàn) APP血清 8型序列抗原性高(圖 2)。通過(guò) DNAstar對(duì)序列分析,結(jié)果表明所得序列是一個(gè)完整的閱讀框。

圖2 DNAStar軟件對(duì) APP血清 8型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的抗原性分析

2.4 核苷酸序列同源性分析

由序列比對(duì)結(jié)果可知 APP血清 8型核苷酸序列與 GenBank已知血清型序列比對(duì)同源性 92%～93%,其中與 APP血清 7型同源性最高 93%,與 APP血清 3,5b型同源性均為 92%。

2.5 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)化分析

比較結(jié)果分為 2大分支,APP血清 8型系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)化關(guān)系見(jiàn)圖 3。其中血清 8型與 APP血清 3,5b型親緣關(guān)系比較近,APP血清 7型在另一個(gè)分支簇。

圖 3 根據(jù)測(cè)序結(jié)果所做的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)化樹(shù)

2.6 結(jié)構(gòu)及功能分析

使用信號(hào)肽分析軟件 SignalP 3.0對(duì)信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,APP血清 8型 1-16 aa為信號(hào)肽區(qū)域(圖 4)。使用蛋白分析軟件 SMART對(duì)黏附基序進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清 8型大量的 Hep_Hag基序密集分布在 132～524 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa(圖 5)。使用自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分析軟件 daTAA對(duì)黏附基序進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清 8型大量的 Ylhead基序密集分布于 130～618 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa(圖 6)。

分析證明,這段序列為三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素結(jié)構(gòu),并且是完整的 N末端結(jié)構(gòu),有著非常好的信號(hào)肽區(qū)域。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用 PCR方法對(duì) APP血清 8型進(jìn)行擴(kuò)增,所得片段為 3 366 bp,首次獲得 APP血清 8型的基因序列并提交 GenBank(bankit1392817 HQ399552)。測(cè)得序列比對(duì)結(jié)果顯示,所得序列為胸膜肺炎放線桿菌。比對(duì)中發(fā)現(xiàn),與已知的序列一致性僅達(dá)到 77.2%。通過(guò) DNAstar軟件對(duì)得到的序列分析發(fā)現(xiàn),APP血清 8型序列抗原性高。對(duì)序列分析結(jié)果表明,所得序列是一個(gè)完整的閱讀框,起始密碼子為ATG,終止密碼子為 TAA,并且是一個(gè)功能蛋白,該基因編碼 1 122個(gè)氨基酸。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn),這段序列可能是三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的一段序列。由序列比對(duì)結(jié)果可知,與 GenBank已知血清型序列比對(duì)同源性 92%～93%,其中與APP血清 7型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的 N段序列同源性最高,達(dá) 93%;與 APP血清 5b型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的 N段序列同源性均為 92%。

圖 4 SignalP 3.0軟件對(duì) APP血清 8型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的信號(hào)肽分析

圖5 SMART軟件對(duì) APP血清 5b,8,7型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的黏附基序比對(duì)分析

圖 6 daTAA軟件對(duì) APP血清 5b,8,7型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的黏附基序比對(duì)分析

自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的序列排布具有典型的特征,包含 N末端信號(hào)肽(signal peptide)、中間的承載結(jié)構(gòu)域(passenger domain)、C末端的轉(zhuǎn)運(yùn)單位(translocation unit)。其中,承載結(jié)構(gòu)域是決定自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的功能的區(qū)域[8]。因此,首先需要運(yùn)用使用信號(hào)肽分析軟件 SignalP 3.0對(duì)信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示APP血清 8型 1～19 aa為信號(hào)肽區(qū)域。目前對(duì)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的研究認(rèn)為,承載結(jié)構(gòu)域 N端的頭部是介導(dǎo)黏附的關(guān)鍵區(qū)域[8]。使用蛋白分析軟件 SMART發(fā)現(xiàn),血清 8型大量的 Hep_Hag基序密集分布于 132～524 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa;Hep_Hag基序與細(xì)菌的黏附、聚集和侵入密切相關(guān);YadA是最早發(fā)現(xiàn)的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素,三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的轉(zhuǎn)運(yùn)單位極為保守,此后在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的所有三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素都是由于其轉(zhuǎn)運(yùn)單位與 YadA的相似而被歸類于三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素亞家族[8,9]。隨后使用 daTAA軟件對(duì)其是否為三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素進(jìn)行進(jìn)一步確定。daTAA是專門用于分析三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的基序和蛋白域的軟件[10],其他的蛋白,包括傳統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,都不能用此軟件得到分析結(jié)果。使用自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素分析軟件 daTAA結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清 8型大量的 Ylhead基序密集分布于 130～618 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了6 aa,與 SMART分析的結(jié)果基本一致,Ylhead就是 YadA-like head,此基序含有 YadA頭部的 NSVAIG-S序列[16];由這兩種軟件的分析結(jié)果及信號(hào)肽分析結(jié)果,此序列為三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素 N端序列,預(yù)測(cè)自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 N端 20～618 aa為黏附的重要功能區(qū)域,使用 DNAStar軟件分析該段具有良好的抗原性。2009年,Auger和 Labrie等[10,11]進(jìn)行 APP體外黏附豬肺上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和生物被膜形成實(shí)驗(yàn)時(shí),都發(fā)現(xiàn)了自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素基因上調(diào)表達(dá)。這些研究說(shuō)明自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素參與了 APP的黏附、聚集和生物被膜形成,可能是 APP新發(fā)現(xiàn)的重要的毒力因子。但是,目前的研究仍未對(duì)自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的黏附功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究證實(shí),所以隨后的實(shí)驗(yàn)是非常重要的。

研究還發(fā)現(xiàn),許多自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有免疫保護(hù)作用,能激活 B細(xì)胞,并且其抗體可阻斷細(xì)胞黏附或動(dòng)物感染,這證明自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素可能成為疫苗的候選因子,在疫苗研制方面具有非常重要的價(jià)值[12]。百日咳桿菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素 pertactin(PRN)已經(jīng)作為一種疫苗組分添加到商品化的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中[13]。所以,APP的自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的研究有著商業(yè)性的歷史意義。開(kāi)展進(jìn)一步的研究,證明自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素與 APP的毒力的關(guān)系,及其功能區(qū)的研究有著深遠(yuǎn)的意義。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)