李林溪,雷連成,高 宇,何伯萍,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一種豬的高度接觸傳染性、致死性呼吸道傳染病[1]。至 20世紀(jì) 80年代已在世界各地廣泛流行。該病可直接損害豬的肺組織,極易造成病豬繼發(fā)感染其他呼吸道疾病,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。發(fā)病率高達(dá) 40%～80%,死亡率6%～20%[3]。迄今為止,APP共有15個(gè)血清型[4],而主要血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù),因而疫苗研制受到阻礙[5]?，F(xiàn)有的 APP疫苗均不能產(chǎn)生令人滿意的、覆蓋多個(gè)血清型的免疫保護(hù)作用。在本研究的前期工作中,在研究 APP血清 1型與 5型的差異表達(dá)蛋白過程中,發(fā)現(xiàn)多個(gè)差異蛋白的編碼基因與痤瘡丙酸桿菌(PA)基因組存在同源序列,同時(shí) ELISA檢測(cè)表明 PA與 APP存在交叉免疫反應(yīng)。提示出 PA具有異源免疫保護(hù) APP的作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),PA免疫小鼠 4周后,可產(chǎn)生抗 APP血清 1型和 5型的抗體。應(yīng)用 APP血清 1型和 5型攻毒,7 d后保護(hù)率分別為 95%和 90%,表明 PA對(duì) 1型和 5型 APP具有顯著保護(hù)。特別是抗 PA高免血清,對(duì) APP攻毒小鼠的保護(hù)率達(dá)到100%[6]。應(yīng)用于豬體的實(shí)驗(yàn)表明,于非特異性免疫刺激劑黃芪多糖免疫相比,免疫 PA組死亡率顯著下降,肺損傷系數(shù)降低,可產(chǎn)生顯著的抗 APP抗體。筆者用 PA活菌及豬抗 PA血清免疫小鼠后,進(jìn)行APP血清 7型和血清 9型的攻毒實(shí)驗(yàn),同時(shí)測(cè)定 PA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗 APP血清 7型和 9型的特異性抗體水平,以期研究 PA對(duì) APP血清 7型和血清 9型的異源免疫保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 菌株及血清

PA分離株 S14,由本校微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離并保存。APP血清 7型(CVCC-265),APP血清 9型 APPS5(CVCC-267)標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。豬抗 PA分離株 S3血清由本校微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠,雌雄各半,6～8周齡,體重 18～22 g,購自長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。飼養(yǎng)條件符合吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理相關(guān)規(guī)定。

1.3 試劑與儀器

BHI培養(yǎng)基(BD,UK);厭氧培養(yǎng)基胰酪解蛋白胨 2 g;酵母浸膏 1 g;葡萄糖 0.6 g;大豆胨 1 g;L-半胱氨酸鹽酸 0.06 g;NaCl 1 g;吐溫-80 0.2 g;蒸餾水 200mL;羊抗鼠二抗購于中杉金橋公司;厭氧培養(yǎng)箱(Don Whitley,UK)。

1.4 PA免疫小鼠抗 APP感染小鼠試驗(yàn)

昆明小鼠分成 4組,每組 10只。實(shí)驗(yàn)組為第 1組、第 2組;對(duì)照組為第 3組、第 4組。第 1組、第 2組小鼠腹腔注射分離得到的 PA分離株 S14,每只 0.2mL(8×109 CFU),第 3組、第 4組小鼠腹腔注射生理鹽水,每只注射 0.2 mL。

將 APP菌接種于 BHI液體培養(yǎng)基,在 37℃培養(yǎng) 6～8 h,用生理鹽水洗滌菌體 3次,恢復(fù)原體積,測(cè)定 OD值,參照 OD值與活菌計(jì)數(shù)的關(guān)系,確定活菌濃度。在首次免疫后的第 17天,第 1組、第 3組用10倍 LD50的 APP血清 7型攻毒,每只小鼠腹腔接種 0.2 mL,約含菌為 8×107CFU;第 2組、第 4組用 10倍 LD50的 APP血 9型攻毒,每只小鼠腹腔接種 0.2mL,約含菌為 7×107CFU。攻毒后每 6 h觀察 1次,觀察 3 d。

1.5 PA免疫小鼠誘導(dǎo)特異性抗 APP血清 7型、9型抗體檢測(cè)

免疫后第 16天,分別將 PA,S14,APP血清 7型,APP血清 9型菌體超聲裂解,工作時(shí)間 20 min,離心 5 000 r/min 5min,取上清留作包被抗原。用包被液 50倍稀釋抗原,每孔加樣 100μL,4℃過夜包被 ELISA反應(yīng)板,進(jìn)行血清抗體檢測(cè)。每組隨機(jī)抽檢 4只,用毛細(xì)管從小鼠眼角采血 20μL,制備血清后,測(cè)定其對(duì)PA和 APP血清 7型、9型的抗體效價(jià),方法參照 Lei等[6]文章,取其均值作為各小組抗體效價(jià)。

1.6 抗 PA血清免疫小鼠后抗 APP感染

將質(zhì)量 18～20 g的昆明小鼠分成 4組,每組 10只,雌雄各半,實(shí)驗(yàn) 5組、6組注射抗 PA血清(免疫豬制備)0.5 mL/只,陰性對(duì)照組 7組、8組每只注射生理鹽水 0.5m L。免疫后 3 h,第 5組、第 7組用 10倍 LD50的 APP血清 7型攻毒,每只腹腔接種 0.2mL,約含菌為 8×107CFU;第 6組、第 8組用 10倍 LD50的 APP血 9型攻毒,每只腹腔接種 0.2m L,約含菌為 7×107CFU。攻毒后每 6 h觀察 1次,觀察 3 d。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠攻毒保護(hù)率

小鼠免疫及攻毒后死亡結(jié)果見表 1。免疫 PA分離株 S14后,應(yīng)用 APP血清 7型攻毒,觀察 3 d后保護(hù)率為 60%;應(yīng)用 APP血清 9型攻毒,保護(hù)率達(dá) 70%。說明PA異源免疫小鼠后,可對(duì) APP多個(gè)血清型(1,5,7,9)提供有效的免疫保護(hù)。小鼠免疫豬抗 PA血清后,對(duì) APP血清 7型、9型感染產(chǎn)生了較強(qiáng)的抵抗力,在 3 d的觀察時(shí)間內(nèi)無一死亡,保護(hù)率達(dá) 100%。說明 PA可能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗 APP的特異性抗體。

2.2 血清效價(jià)

PA分離株 S14免疫小鼠后,可產(chǎn)生對(duì) APP血清 7型、9型的特異性抗體(表 2)。其中抗 APP血清7型平均抗體效價(jià)達(dá)1 800,抗 APP血清 9型平均抗體效價(jià)達(dá) 2 800。說明 PA免疫后可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)抗 APP感染的特異性體液免疫應(yīng)答。

表 1 動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 2 血清效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)是自然界中的常見微生物,與人類痤瘡炎癥的發(fā)生有關(guān)[7],具有增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)入侵病原應(yīng)答效果的作用,與機(jī)體呈共生關(guān)系[8]。PA可非特異性的提高動(dòng)物的免疫水平,增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)寄生蟲[9]、細(xì)菌[10]、病毒[11]等多種病原微生物的抵抗力。作為動(dòng)物的非特異性免疫刺激劑已有商品化產(chǎn)品問世[12],在科研中用于建立非特異性免疫應(yīng)答的動(dòng)物模型[13]及免疫佐劑[14]。但迄今為止仍無 PA用于特異性異源免疫的其他報(bào)道。

本課題組對(duì) PA誘導(dǎo)小鼠及豬只產(chǎn)生對(duì) APP的特異性免疫保護(hù)進(jìn)行了多項(xiàng)研究,現(xiàn)已證明 PA免疫小鼠[15]或豬只[6]后,對(duì) APP 1型及 5型感染均有顯著的免疫保護(hù)作用,具有開發(fā)為異源疫苗或其他相關(guān)生物制品的潛力。本次研究進(jìn)一步證明了 PA對(duì) APP其他血清型同樣具有顯著的免疫保護(hù)作用,為解決 APP多血清型之間無有效的交叉抗原這一一直困擾疫苗開發(fā)工作的難題提供了新的解決思路。同時(shí),PA誘導(dǎo)特異性免疫保護(hù)的機(jī)理以及免疫保護(hù)有效成分的分離和鑒定將是下一步研究的著眼點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)