毛跟年， 李 鑫， 瞿建波， 郭 倩

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前言

乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級(jí)或二級(jí)醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)[1].在人類(lèi)和其他許多動(dòng)物體內(nèi)，線粒體乙醛脫氫酶能轉(zhuǎn)化對(duì)生物體有害的醇類(lèi)，所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到了高度關(guān)注[2].同時(shí)，乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及與其相關(guān)疾病的檢測(cè)方面也多有應(yīng)用.因此，乙醛脫氫酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值.

作者探討了從廢棄啤酒酵母中提取乙醛脫氫酶，將凍融與超聲波相結(jié)合破碎細(xì)胞，并對(duì)提取過(guò)程的一系列因素進(jìn)行了考察，確定了提取乙醛脫氫酶的最佳工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)，752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司),牛血清白蛋白(陜西化玻器械有限公司)，輔酶I(Roche公司)，廢棄啤酒酵母(西安藍(lán)馬啤酒有限公司提供)，其他試劑均為市售，純度為分析純.

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)測(cè)定

采用考馬斯亮蘭染色法，以考馬斯亮蘭G250為蛋白結(jié)合物，在595 nm下比色，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2.2 ALDH的測(cè)定

參考趙玉鳳、雷明科[3]等3 mL反應(yīng)體系：乙醛脫氫酶可以催化NAD+成為NADH，在340 nm輔酶NADH有明顯吸收而氧化型NAD+無(wú)吸收，定義每分鐘產(chǎn)生1 μmoL的NADH所需要的酶量為1個(gè)活力單位(U).

1.2.3 啤酒廢酵母預(yù)處理方法

將收集的啤酒廢棄酵母液先過(guò)120目篩子，除去酒花等大顆粒物質(zhì)，然后加入0.5% NaHCO3洗滌0.5 h，除苦味，最后3 000 g離心棄上清液得酵母泥.

1.2.4 啤酒廢酵母乙醛脫氫酶提取方法[4，5]

取經(jīng)預(yù)處理的冷凍啤酒酵母，放入4 ℃賬冰箱解凍12 h，然后用超聲波細(xì)胞破碎儀在不同超聲強(qiáng)度及不同提取時(shí)間、不同提取液濃度、不同料液比、不同提取液pH值下進(jìn)行提取，然后在10 000 g下離心15 min，除去雜質(zhì)，收集上清液并測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 不同料液比對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

取經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母10 g用0.01 M、pH 7.0的磷酸緩沖液分別稀釋1,2,3,4,5倍，在低溫(10 ℃以下)、超聲功率200 W (超聲3 s，間歇1 s)下提取10 min，10 000 g離心取上清液分別測(cè)定其蛋白質(zhì)含量及酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 不同料液比對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響圖2 不同超聲強(qiáng)度對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

由圖1可見(jiàn)，酵母用量與提取液比率對(duì)乙醛脫氫酶的提取有一定影響，當(dāng)料液比從1∶1增至1∶3時(shí)，提取液中蛋白質(zhì)含量和乙醛脫氫酶活力明顯增加；當(dāng)繼續(xù)增加至1∶4、1∶5時(shí)，提取液中蛋白質(zhì)含量和乙醛脫氫酶活力增加不明顯，基本趨于穩(wěn)定.因此，料液比選擇1∶3較合適.

2.1.2 不同超聲強(qiáng)度對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

取經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母10 g與0.01 M、pH 7.0 的磷酸緩沖液按1∶3(w/v) 倍比率混合，在低溫、超聲功率分別為100 W、150 W、200 W、250 W、300 W、350 W和400 W的條件下提取10 min，離心取上清液分別測(cè)定蛋白含量及酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖2.

由圖2可見(jiàn)，隨著超聲強(qiáng)度的增加蛋白質(zhì)含量和酶活力呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明超聲功率對(duì)破碎效果有很大的影響，輸出功率的增大有利于“空穴”作用的增強(qiáng)，從而使破碎效率增大，但超聲功率超過(guò)350 W時(shí)酶活力表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，可能超聲功率過(guò)大時(shí)影響了酶的空間結(jié)構(gòu).從圖2可以看出，超聲功率為350 W時(shí)酶活力最高.

2.1.3 不同超聲時(shí)間對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

取經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母20 g與0.01 M、pH 7.0的磷酸緩沖液按1∶3比率混合，在低溫、超聲功率350 W下每間隔4 min停止超聲，混勻提取液并取樣5mL，離心取上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響圖4 不同提取液pH對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

由圖3可見(jiàn)，蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的增加而增大，在破碎至36 min時(shí)蛋白質(zhì)含量增加已不明顯.在0～32 min之間，ALDH活力隨時(shí)間的增加而增大；在36～48 min之間，ALDH活力隨時(shí)間的增加而下降，說(shuō)明超聲波使部分酶失活.

2.1.4 不同提取液pH對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

取經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母10 g與0.01 M的不同pH磷酸緩沖液按1∶3比率混合，在低溫、超聲功率350 W下提取32 min，離心取上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖4.

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)提取液的pH從3.0增至4.0時(shí)，乙醛脫氫酶的活性顯著升高，在pH 4.0處達(dá)到峰值，再增大pH至5.0，提取活性顯著降低，繼續(xù)增大提取液pH至9，則提取活性又隨提取液pH的增大而逐漸升高，并在pH 8.5處達(dá)到第二個(gè)峰值，此后隨pH的增大提取活性又迅速下降.可能是乙醛脫氫酶在不同pH下的溶解性和穩(wěn)定性不同，導(dǎo)致其提取活性存在差異.

2.1.5 不同提取液濃度對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

取經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母10 g與pH 8.5的不同濃度的磷酸緩沖液按1∶3比率混合，在低溫、超聲功率350 W下提取32 min，離心取上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活，其結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖5 不同提取液濃度對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響圖6 提取次數(shù)對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

由圖5可見(jiàn)，提取液濃度不同，對(duì)乙醛脫氫酶提取影響也很大，當(dāng)提取液濃度低于0.05 mol/L時(shí)，隨著提取液濃度的增大，乙醛脫氫酶的提取活性也呈增加趨勢(shì)，在0.05 mol/L時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)提取液濃度高于0.05 mol/L時(shí)，提取活性隨提取液濃度增加呈下降趨勢(shì).因此，提取乙醛脫氫酶以選擇0.05 mol/L提取液濃度為宜.

2.1.6 超聲提取次數(shù)對(duì)乙醛脫氫酶提取的影響

將經(jīng)預(yù)處理的凍融酵母10 g與0.05 M、pH 8.5的磷酸緩沖液按1∶3比率混合，在低溫、超聲功率350 W下提取32 min，離心后所得上清液為第一次提取液.第二次、第三次提取時(shí)，方法與第一次相同，離心收集各次的上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量及酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6.

由圖6可見(jiàn)，隨著提取次數(shù)的增多，乙醛脫氫酶活力顯著下降.超聲前2次的提取活性占3次總提取活性的93.2%，第3次僅有6.8%，因此超聲提取酵母乙醛脫氫酶以2次提取為宜.

2.2 正交試驗(yàn)分析

為了確定在多因素條件下的最佳超聲強(qiáng)度、超聲時(shí)間、提取液pH和提取液濃度與單因素試驗(yàn)結(jié)果是否吻合，進(jìn)行了正交試驗(yàn).以酶活力為考察指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由表1極差分析結(jié)果可知，影響啤酒酵母乙醛脫氫酶提取的主要因素是超聲功率，而提取液濃度影響較小，各因素的主次順序是A>C>B>D,最優(yōu)提取方案為A2B2C2D2，即以0.05 M、pH 8.5的磷酸緩沖液為提取液，在料液比1∶3(w/v)、超聲功率350 W、超聲提取時(shí)間32 min條件下所得酶活最高，這與單因素條件下的試驗(yàn)結(jié)果是相同的.按照最優(yōu)提取方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得酶活力為11.2 U.

3 結(jié)論

(1)采用凍融-超聲相結(jié)合的方法對(duì)啤酒廢酵母中的ALDH進(jìn)行提取，得到的最優(yōu)工藝條件為：稱(chēng)取10 g經(jīng)凍融處理的酵母，加入3倍體積0.05 M、pH 8.5的磷酸緩沖液，在超聲功率350 W下超聲3 s、間歇1 s，超聲全程時(shí)間為32 min，操作溫度控制在10 ℃以下.在此條件下，超聲提取一次獲得的酶活力最高，可以達(dá)到11.2 U/10 g廢酵母.

(2)考慮到酵母細(xì)胞壁較厚和超聲功率對(duì)酶活性的影響，提取應(yīng)分多次進(jìn)行.試驗(yàn)表明：在最優(yōu)工藝條件下，超聲提取2次就能夠獲得較好的效果.

參考文獻(xiàn)

[1] Todd L. Kelson, Julie R. Secor McVoy, William B. Rizzo. Human liver fatty aldehyde dehydrogenase: microsomal localization, purification, and biochemical characterization[J]. Biochimica et. Biophysica Acta, 1997, 1 335: 99-110.

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