賈翠英，張玉輝，魏均玲

（河南科技學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

人參皂苷（Ginsenoside）是人參的主要活性成分，目前已分離并鑒定的人參皂苷達(dá)60余種，各種人參皂苷都有其獨(dú)特的生理活性。大量研究結(jié)果表明，人參皂苷具有抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機(jī)體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[1－4]。許多藥代動(dòng)力學(xué)證明人參皂苷具有在腸道內(nèi)難以吸收、生物利用度低、腸內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)，在人體內(nèi)難以直接發(fā)揮藥效作用的弊端，因此需經(jīng)腸道細(xì)菌的酶分解為人參皂苷苷元而發(fā)揮療效。要解決此問題，最有效的途徑便是進(jìn)行人參皂苷化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。目前，人參皂苷糖基改造的方法有化學(xué)法和生物酶法[5]。化學(xué)法是指用化學(xué)催化水解皂苷糖基。該方法具有水解操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但也存在專一性差，同時(shí)易造成環(huán)境污染的弊端。生物酶法則具有反應(yīng)條件溫和，高專一性和高效性，無污染等優(yōu)點(diǎn)，因此是一種行之有效的好方法[6]。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道很多[7-12]，然而有關(guān)利用固定化細(xì)胞進(jìn)行人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道仍是空白。固定化技術(shù)利用活細(xì)胞或酶的高度密集，可以使普通游離狀態(tài)的細(xì)胞成倍增長(zhǎng)，具有加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)周期，提高工作效率的優(yōu)點(diǎn)。因此，通過使用該技術(shù)提高微生物發(fā)酵強(qiáng)度是一種切實(shí)可行的方法。包埋法是近年來發(fā)展迅速的一種新興細(xì)胞固定化技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活性影響較小，效率高等優(yōu)點(diǎn)。它是目前細(xì)胞固定化研究和應(yīng)用最廣泛的方法[13]。海藻酸鈉具有價(jià)格低廉、容易固定、耐生物分解性好、無毒等優(yōu)點(diǎn)。因此，它是一種極為理想的包埋劑[14-15]。利用固定化細(xì)胞進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)的方法具有可重復(fù)利用微生物菌種及省去菌種活化、制備等繁瑣步驟的優(yōu)點(diǎn)，并且該方法還具有便于分離產(chǎn)物與菌體和將發(fā)酵生產(chǎn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)[16]。因此，本研究嘗試?yán)煤Ｔ逅徕c包埋的酵母菌進(jìn)行人參皂苷生物轉(zhuǎn)化，通過制備固定化酵母菌和利用固定化酵母進(jìn)行人參皂苷生物轉(zhuǎn)化，建立了體外微生物轉(zhuǎn)化模型，獲得了理想的人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率，從而提高了人參皂苷在人體中的藥效和利用率。

1 材料與方法

1.1 菌株

酵母菌是一株高溫釀酒酵母菌，由河南科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，KH2PO40.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，瓊脂2%，pH 5～6，高壓滅菌鍋滅菌30 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏1%，KH2PO40.1%，硫酸鎂 0.01%，pH 5～6，高壓滅菌鍋滅菌30 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

4%粗品人參皂苷，用自來水配制，用0.1 mol·L-1HCl調(diào) pH 5～6，于120 ℃滅菌 15～20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化與液體種子制備

無菌條件下將冰箱中保藏的酵母菌取一環(huán)于斜面培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱36℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化兩代。

用接種環(huán)取活化好的斜面菌苔種3環(huán)，接種于250 mL內(nèi)盛30 mL滅菌的新鮮種子培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，36 ℃，160 r·min-1培養(yǎng)24 h。

活菌計(jì)數(shù)：取1 mL培養(yǎng)好的液體種子，加入9 mL蒸餾水，混勻。然后從中再取1 mL移至另一試管中，加入9 mL蒸餾水，混勻，得到稀釋100倍的菌液。取0.1 mL稀釋100倍的菌液滴至活菌計(jì)數(shù)板上，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均數(shù)，按下列公式計(jì)算每毫升菌液中所含的酵母菌細(xì)胞數(shù)[17]：

酵母菌細(xì)胞數(shù)（個(gè)·mL-1）=（100小格酵母細(xì)胞數(shù)/100）×400×10 000×菌液稀釋倍數(shù)

酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果見下表1。

表1 酵母菌細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果（稀釋100倍）Table 1 Results of yeast cell numbers determined by counter(diluted 100 times）

1.3.2 固定化酵母菌制備及發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的酵母菌液體種子進(jìn)行海藻酸鈉包埋制備固定化酵母菌。其制備方法如下：稱取一定濃度滅過菌的海藻酸鈉于無菌的小燒杯中，加少許無菌去離子水，調(diào)成糊狀，補(bǔ)充剩余的水使總量一定?；鹕霞訙刂寥刍?，冷卻至45℃左右，加入一定接種量的酵母菌培養(yǎng)液，混合均勻，用5號(hào)針頭以恒定的速度滴到盛有一定濃度CaCl2（膠誘導(dǎo)劑）溶液的平皿中制成凝膠珠，浸泡一定時(shí)間后，所得凝膠珠即為固定化酵母菌。將固定化酵母菌用無菌去離子水洗滌3次后用于人參皂苷生物轉(zhuǎn)化。其轉(zhuǎn)化條件為每250 mL三角瓶中裝入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，36℃搖床培養(yǎng)72 h，測(cè)定生物轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵試驗(yàn)分別考察不同包埋時(shí)間、不同酵母菌接種量、不同海藻酸鈉濃度、不同CaCl2濃度對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響。

1.4 檢測(cè)與計(jì)算方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶于50 mL的容量瓶中，制得0.1 mg·mL-1的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取Rb1標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于已編號(hào)的具塞試管中，分別定容至1.4 mL。準(zhǔn)確加入0.5 mL 8%的香蘭素乙醇溶液（用無水乙醇現(xiàn)配），5 mL 77%的硫酸溶液，混合均勻，置于60℃水浴上恒溫10 min，然后立即取出，放入冰水浴15 min，取出放置至室溫，顯示溶液于540 nm處測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，以人參皂苷Rb1含量為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。

1.4.2 發(fā)酵液檢測(cè)與轉(zhuǎn)化率計(jì)算

取發(fā)酵液1.4 mL，參照人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行發(fā)酵液中人參皂苷Rb1含量的測(cè)定，根據(jù)發(fā)酵前后發(fā)酵液中人參皂苷Rb1含量的變化（由吸光值決定），計(jì)算固定化酵母菌對(duì)人參皂苷Rb1的生物轉(zhuǎn)化率，計(jì)算公式如下：

T：生物轉(zhuǎn)化率；A0：空白對(duì)照發(fā)酵液的吸光值；A1：固定化酵母菌轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可知，R2=0.9997，說明人參皂苷Rb1在濃度為0.2～1.2 mg·mL-1范圍內(nèi)吸光度與濃度具有良好的相關(guān)性。

圖1 人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Rb1

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 包埋時(shí)間對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響

參考以往關(guān)于海藻酸鈉包埋法制備固定化細(xì)胞的條件[14－15]，采用固定海藻酸鈉濃度為4%，CaCl2濃度為10%，接種量為10%及裝液量為30 mL，分析不同包埋時(shí)間對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響。包埋時(shí)間分別設(shè)置為5、15、25、35、45、55、65 min，且每一包埋時(shí)間設(shè)3個(gè)平行，以未加入固定化酵母菌的人參皂苷溶液作對(duì)照，最后取平均值，其中對(duì)照值A(chǔ)0的平均值為0.708，參照前文所述的生物轉(zhuǎn)化率公式計(jì)算，結(jié)果如圖2所示。

圖2 包埋時(shí)間對(duì)酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.2 Influence of embedding time on ginsenoside Rb1 biotransformation with yeast

由圖2可知，在0～35 min內(nèi)，包埋時(shí)間越長(zhǎng)，固定效果越好，轉(zhuǎn)化率越高。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，所得固定化凝膠小球的強(qiáng)度越高，固定效果越好。在35～45 min時(shí)，可獲得較高的生物轉(zhuǎn)化率，且最大值為30.68%，但隨著包埋時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率平緩下降，原因主要是失水收縮，造成部分細(xì)胞活力下降或喪失，導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化率下降。

2.2.2 接種量對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響

本試驗(yàn)采用固定海藻酸鈉濃度為4%，CaCl2濃度為10%，包埋時(shí)間為40 min，裝液量為30 mL，分析酵母菌不同接種量對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響。接種量分別設(shè)置為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%，且每個(gè)接種量設(shè)3個(gè)平行，以未加入固定化酵母菌的人參皂苷溶液作對(duì)照，最后取平均值，其中對(duì)照值A(chǔ)0的平均值為0.691，參照前文所述的生物轉(zhuǎn)化率公式計(jì)算，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，轉(zhuǎn)化率先隨接種量的增加而增大，然后開始下降。其原因可能是接種量較小時(shí)，所包埋的酵母菌數(shù)量少，因此，其活力相對(duì)較低，表現(xiàn)出較低的生物轉(zhuǎn)化率。但是過高的接種量，必然造成菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)而出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足，容易自溶。因此，7%的接種量可獲得最大生物轉(zhuǎn)化率為29.96%。

圖3 接種量對(duì)酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.3 Influence of inoculum size on ginsenoside Rb1 biotransformation with yeast

2.2.3 海藻酸鈉濃度對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響

試驗(yàn)采用固定CaCl2濃度10%、包埋時(shí)間40 min、接種量10%、裝液量為30 mL，分析不同海藻酸鈉濃度對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響。海藻酸鈉濃度設(shè)置為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%，每一濃度設(shè)3個(gè)平行，以未加入固定化酵母菌的人參皂苷溶液作對(duì)照，最后取平均值，其中對(duì)照值A(chǔ)0的平均值為0.722，參照前文所述的生物轉(zhuǎn)化率公式計(jì)算，結(jié)果如圖4所示。

圖4 海藻酸鈉濃度對(duì)酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.4 Influence of sodium alginate concentration on ginsenoside Rb1 biotransformation with yeast

海藻酸鈉是一類天然高分子多糖，對(duì)微生物無毒害作用。但是海藻酸鈉的濃度會(huì)影響固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度、質(zhì)量傳遞等，進(jìn)而影響到微生物的活性[8]。如圖4所示，海藻酸鈉的濃度增加，轉(zhuǎn)化率先增加，然后會(huì)減少。由此推測(cè)海藻酸鈉濃度對(duì)包埋小球機(jī)械強(qiáng)度有影響。較低時(shí)，其所形成的膠球機(jī)械強(qiáng)度較小，容易破裂，包埋效果不好，而影響到酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的效率。隨著海藻酸鈉濃度的增高，粘性增加，膠球機(jī)械強(qiáng)度也增加，膠球穩(wěn)定。但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，粘性過大，給固定化操作帶來不便。因此，海藻酸鈉的濃度應(yīng)選在3%～5%，此時(shí)被包埋的酵母菌有最高的生物轉(zhuǎn)化率為28.45%～29.38%。

2.2.4 CaCl2濃度對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響

結(jié)果見圖5。

圖5 CaCl2 濃度對(duì)對(duì)酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.5 Influence of calcium chloride concentration on ginsenoside Rb1 biotransformation with yeast

試驗(yàn)采用固定海藻酸鈉4%，包埋時(shí)間40 min，接種量為10%及裝液量為30 mL，分析CaCl2濃度對(duì)人參皂苷生物轉(zhuǎn)化率的影響。CaCl2濃度分別設(shè)置為2%、5%、8%、10%、12%、15%、18%，每一濃度設(shè)3個(gè)平行，以未加固定化酵母菌的人參皂苷溶液作對(duì)照，最后取平均值。其中對(duì)照值A(chǔ)0的平均值為0.683，參照前文所述的生物轉(zhuǎn)化率公式計(jì)算，結(jié)果如圖5所示。

在海藻酸鈉包埋固定化過程中，固定劑CaCl2中的鈣離子與海藻酸根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細(xì)胞固定[8]。如圖5所示，當(dāng)CaCl2為低濃度時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨濃度增加而增加。而隨著CaCl2濃度的進(jìn)一步增加，微生物細(xì)胞的活性降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。可能是由于鹽的高滲透壓作用，引起細(xì)胞脫水，致使微生物活性部分喪失。另外，由圖5可知，當(dāng)CaCl2濃度在8%～10%之間時(shí)，固定化酵母菌對(duì)人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化率較高，且生物轉(zhuǎn)化率最高值為29.71%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、包埋時(shí)間、接種量為研究對(duì)象，列出四因素三水平的正交試驗(yàn)表[19]，每種組合設(shè)3次重復(fù)，以未加入固定化酵母菌的人參皂苷溶液作對(duì)照，最后取平均值。其中對(duì)照值A(chǔ)0的平均值為0.692，參照前文所述的生物轉(zhuǎn)化率公式計(jì)算結(jié)果。

表2 試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of experiment

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment of L9（34）

續(xù) 表

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis results of variance

由表3可知，海藻酸鈉包埋時(shí)間，酵母菌接種量，海藻酸鈉濃度及CaCl2濃度對(duì)固定化后的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的轉(zhuǎn)化率均有一定的影響，根據(jù)極差結(jié)果顯示，各因素的影響順序?yàn)楹Ｔ逅徕c包埋時(shí)間＞CaCl2濃度＞海藻酸鈉濃度＞接種量。另外，由表3可知，海藻酸鈉包埋法制備酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的最佳細(xì)胞固定化工藝條件為包埋時(shí)間45 min，接種量7%，海藻酸鈉濃度5%，CaCl2濃度10%，在此條件下可獲得最高生物轉(zhuǎn)化率為31.51%。由表4的F測(cè)驗(yàn)分析可知，在該試驗(yàn)中海藻酸鈉包埋時(shí)間，酵母菌接種量，海藻酸鈉濃度及CaCl2濃度對(duì)人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化率均有顯著的影響。以上結(jié)果分析表明：當(dāng)酵母菌液體種子濃度為1.25×108個(gè)·mL－1時(shí)，在上述最佳固定化工藝條件下所制備的固定化酵母菌，進(jìn)行人參皂苷生物轉(zhuǎn)化時(shí)就可以獲得預(yù)期最高生物轉(zhuǎn)化率。

3 討論

a.海藻酸鈉包埋酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響因素很多，除了海藻酸鈉濃度，包埋時(shí)間，CaCl2濃度及酵母菌細(xì)胞濃度外，所制備的凝膠小球的大小直徑以及制備固定化酵母菌時(shí)所選用的初始酵母菌細(xì)胞活力大小等對(duì)后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化率也有一定的影響。

b.通常凝膠小球直徑越大，越不利于傳質(zhì)，易造成凝膠小球內(nèi)部的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給不足，積累的代謝產(chǎn)物過多，最后造成凝膠小球內(nèi)部環(huán)境惡化，使得凝膠小球內(nèi)微生物細(xì)胞死亡數(shù)目增多[21－23]。此外，固定化過程中所使用的CaCl2作為一種固定劑同時(shí)也是一種無機(jī)鹽，無機(jī)鹽的高滲透壓作用,易引起細(xì)胞脫水，致使微生物活性部分喪失。在利用海藻酸鈉包埋法制備固定化酵母菌時(shí)需要考慮到凝膠小球的直徑和酵母菌的活力。

4 結(jié)論

本文通過海藻酸鈉包埋法制備固定化酵母菌并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的試驗(yàn)，結(jié)果證明固定化的酵母菌對(duì)人參皂苷Rb1有較好的轉(zhuǎn)化能力和轉(zhuǎn)化效率，通過單因素和正交試驗(yàn)，得出了海藻酸鈉包埋法制備固定化酵母菌的最佳條件即：包埋時(shí)間為45 min，接種量為7%，海藻酸鈉濃度為5%，CaCl2濃度為10%，在此條件下可獲得最高生物轉(zhuǎn)化率為31.51%，較以往研究的非固定化酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的生物轉(zhuǎn)化率提高約3%～5%[11]，而且固定化的酵母菌可以多次重復(fù)利用并簡(jiǎn)化滅菌、菌種活化等繁瑣操作步驟[20]。因此，該研究為人參皂苷Rb1生物轉(zhuǎn)化提供了新思路和新方法。

[1]張萍,張南平,肖新月.人參皂苷類成分的化學(xué)分析[J].藥物分析雜志,2004,24(3):229-237.

[2]劉曉暉,朱鯤鵬.人參皂苷Rb1的研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,15(1):82-84.

[3]李向高.人參皂苷Rb1的藥理作用研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(6):649-652.

[4]王立青,江榮高.人參皂苷Rb1的藥理活性[J].國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè),2005,20(6):245-247.

[5]李泰平.人參皂苷藥理活性的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué),2003,12(4):1-3.

[6]姜彬慧,胡筱敏,左小紅.酶技術(shù)與中藥現(xiàn)代化[J].藥學(xué)報(bào),2002,34(4):134-137.

[7]馬吉?jiǎng)?周秋麗,費(fèi)曉方,等.真菌對(duì)人參皂苷Rb1及人參二醇系皂苷的代謝作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2001,36(8):603-605.

[8]李梁,盧明春,魚紅閃.從一種新篩選的菌中找出人參皂苷酶[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2003(3):164-166.

[9]王毅,劉鐵漢,王巍,等.腸內(nèi)菌群對(duì)人參皂苷Rg1的代謝轉(zhuǎn)化作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2001,3(3):26-29.

[10]劉明杰,林琳,王釗.腸道細(xì)菌對(duì)天然藥物代謝的研究進(jìn)展Ⅱ[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2001,18(4):2-5.

[11]賈翠英,張玉輝,賈斌.酵母菌半連續(xù)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的條件優(yōu)化[J].生物學(xué)雜志,2009,26(6):41-44.

[12]賈翠英,張玉輝,常景玲.酵母菌生長(zhǎng)與產(chǎn)人參皂苷β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)模型[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào),2009,41(12):109-111.

[13]肖美燕,徐爾尼,陳志文.包埋法固定化細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(4):158-161.

[14]梁峙,趙孝華.海藻酸鈉固定化酵母菌的應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2002,23(12):34-35.

[15]張良,陳錫時(shí).細(xì)胞固定化技術(shù)-海藻酸鈉包埋法的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(7):1281-1284.

[16]Plessas S,Argyro,Kanellaki B,et al.Use of immobilized cell biocatalysts in baking process biochemistry[J].Process Biochemistry,2007,42(8):1244-1249.

[17]常景玲,李蘭.釀酒酵母細(xì)胞固定化與酒精發(fā)酵.生物工程大實(shí)驗(yàn)[M].新鄉(xiāng):河南科技學(xué)院發(fā)酵工程教研室編制印刷,2007:5-6.

[18]高麗萍,劉華,封云芳.人參總皂苷的含量測(cè)定[J].浙江工程學(xué)院學(xué)報(bào),2002,19(3):171-174.

[19]崔秀珍.生物統(tǒng)計(jì)分析[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版,2002:87-173.

[20]Swain M R,Kar S,Sahoo A K,et al.Ethanol fermentation of mahula(Madhuca latifolia L.)flowers using free and immobilized yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Microbiological Research,2007,162(2):93-98.

[21]Idris A,Suzana W.Effect of sodium alginate concentration,bead diameter,initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii[J].Process Biochemistry,2006,41(5):1117-1123.

[22]Klinkenberg G,Lystad K Q,Levine D W,et al.Cell release from alginate immobilized Lactococcus lactis ssp.lactis in chitosan and alginate coated beads[J].Journal of Dairy Science,2001,84(5):1118-1127.

[23]Podrazky O,Kuncova G.Determination of concentration of living immobilized yeast cells by fluorescence spectroscopy[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2005,107(1):126-134.