郭文超,牛 凡,路映攀

近年有研究表明某些炎性細(xì)胞因子,如C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用[1]。Toll樣受體4蛋白(Toll like receptor 4,TLR4)是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫中的細(xì)胞跨膜受體及病原模式識別受體。有資料顯示,TLR4信號傳導(dǎo)缺陷可明顯減輕缺血再灌注期間與心肌損傷加重相關(guān)的炎癥反應(yīng),提示TLR4可能介導(dǎo)了心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)[2]。本實驗應(yīng)用大鼠心肌缺血再灌注模型,觀察培哚普利對缺血再灌注心肌細(xì)胞Toll樣受體4蛋白的影響,并探討培哚普利對心肌缺血再灌注損傷可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及其分組 健康成年W istar大鼠(清潔級,山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗中心提供)30只,體重220 g～300 g,雌雄不限,隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和培哚普利組,每組10只。培哚普利組灌服培哚普利4mg/kg,每日1次,共7 d,假手術(shù)組及缺血再灌注組灌服等量生理鹽水,每日1次,共7 d。

1.2 藥品與試劑 TUNEL試劑盒,TLR4蛋白一抗為兔抗大鼠多克隆抗體(美國Oncogene公司),二抗為人抗兔S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。培哚普利片(施維雅,天津制藥有限公司生產(chǎn)),肝素注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。

1.3 動物模型的制作 烏拉坦5 m L/kg腹腔注射麻醉,氣管插管進(jìn)行呼吸機(jī)輔助呼吸(HX200動物呼吸機(jī),成都泰盟科技有限公司),呼吸頻率50/m in,潮氣量20m L/kg,四肢皮下插入針形電極描記心電圖,沿胸骨左緣開胸,于第3、4肋間行縱向切口,剪斷肋骨,破胸膜,心包膜,在左冠狀動脈前降支起始部,用6～0絲線穿過心肌淺層,將絲線兩端一起穿入直徑為1 mm的聚乙烯管中,穩(wěn)定1 m in后抽緊線,將聚乙烯管壓向冠狀動脈并與絲線一并夾住,阻斷冠脈血流,造成心肌缺血。45 m in后放松聚乙烯管和絲線,以造成再灌注損傷模型。以心電圖ST段抬高,局部心肌出現(xiàn)發(fā)紺為缺血形成,以心電圖ST段降低,寬大畸形Q波出現(xiàn)作為模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)。再灌注1 h后處死動物,取缺血區(qū)心肌組織,10%中性甲醛4℃固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切成厚5μm切片備用。假手術(shù)組只在左冠狀動脈前降支下穿線,不結(jié)扎,余步驟同上。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 光鏡觀察切片 切片行HE染色,光鏡下觀察心肌組織毛細(xì)血管腔和管壁的變化,以及心肌細(xì)胞與間質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變。

1.4.2 細(xì)胞凋亡指數(shù) 切片常規(guī)二甲苯脫蠟及梯度乙醇入水后,應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法原位標(biāo)記心肌凋亡細(xì)胞核。每一組均設(shè)陰性對照,用PBS液代替一抗作為陰性對照,正常細(xì)胞核呈藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞核呈棕黃色。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)5個高倍視野中凋亡陽性心肌細(xì)胞核數(shù)目及其占總細(xì)胞核數(shù)目的比例,計算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.4.3 TLR4蛋白平均積分光密度 切片經(jīng)苯和梯度乙醇脫蠟,于3%的過氧化氫甲醇溶液中浸泡30 m in,在二胺四乙酸(0.01 mol/L,pH 8.0)中加熱20 m in,經(jīng)PBS漂洗3次后,于正常山羊血清中孵育10m in。一抗為兔抗大鼠TLR4蛋白多克隆抗體,二抗為抗兔S-P試劑盒。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素襯染、透明、脫水、封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。細(xì)胞質(zhì)顯示棕黃色為TLR4蛋白表達(dá)陽性。顯微圖像采集系統(tǒng)對每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400),利用Image.Pro Plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件分析陽性的平均灰度值(0～255范圍內(nèi),灰度值與染色強(qiáng)度成反比),求出平均積分光密度(averageintegrate op tica l density,A IOD)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異采用單因素方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué)變化 缺血再灌注組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,心肌細(xì)胞變性,可見小灶性壞死。心肌間質(zhì)小灶性出血,炎細(xì)胞呈小片狀浸潤,肌漿內(nèi)形成收縮帶。培哚普利組心肌間質(zhì)輕度水腫,肌漿凝聚,少數(shù)炎細(xì)胞浸潤,肌漿內(nèi)形成收縮帶,心肌間質(zhì)少數(shù)紅細(xì)胞浸潤,損傷較缺血-再灌注組明顯減輕。假手術(shù)組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞心肌細(xì)胞未見明顯損傷。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)培哚普利組為(7.2±2.4)%,假手術(shù)組為(1.6±0.4)%,缺血再灌注組為(10.5±3.9)%,培哚普利組較缺血再灌注組低(P＜0.05),但高于假手術(shù)組(P＜0.05)。

2.3 TLR4蛋白平均積分光密度 AIOD培哚普利組為8.47±2.96,缺血再灌注組為13.75±2.59,假手術(shù)組為2.48±1.15,培哚普利組較缺血再灌注組低(P＜0.05),但高于假手術(shù)組(P＜0.05)。

3 討 論

目前,缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明,氧自由基生成、鈣超載和白細(xì)胞激活可能是其發(fā)生的主要機(jī)制[3]。心肌缺血再灌注會導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),其已成為心肌缺血再灌注損傷的特征,包括活性氧的產(chǎn)生、補(bǔ)體的激活及多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)的浸潤等[4],而PMN的浸潤是心肌缺血再灌注后的主要問題。缺血再灌注損傷通過細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和氧自由基誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)使得心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[5]。國內(nèi)亦有研究顯示,TLR4在正常及缺血的心肌細(xì)胞中均有表達(dá),心肌缺血恢復(fù)血液灌注后,TLR4的表達(dá)迅速上調(diào),再灌注1 h達(dá)到峰值,TLR4可能通過促進(jìn)炎性因子如TNF-α的產(chǎn)生分泌增多來介導(dǎo)心肌的炎性損傷[6]。

本實驗結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注使心肌炎癥反應(yīng)劇烈,光鏡下見到血管壁中性粒細(xì)胞大量浸潤,心肌纖維腫脹,從而支持炎癥反應(yīng)參與心肌缺血再灌注損傷。經(jīng)培哚普利處理后的心肌炎癥反應(yīng)明顯減輕,表明培哚普利對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。近來研究表明培哚普利等血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑能抑制循環(huán)和組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE),減少血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的形成,并作用于激肽酶Ⅱ,抑制緩激肽的降解,提高緩激肽水平,起到改善內(nèi)皮功能,抑制炎癥反應(yīng),拮抗心肌缺血再灌注損傷[7,8]。本研究亦顯示培哚普利可減少在體大鼠心肌缺血再灌注60 m in時心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),抑制AngⅡ,從而通過減少Toll樣受體4蛋白而減輕IL-6、TNF-α等表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),保護(hù)缺血再灌注心肌。但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究,對TLR4介導(dǎo)的信號通路的進(jìn)一步研究將為缺血再灌注損傷的防治提供新的靶點。

[1] Zeuke S,U lmer AJ.Kusumoto S.et a l.TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J].Cardiovasc Res,2002,56:126-134.

[2] Oyama J,Blais C,Liu X,et al.Reduced myocardial ischemia reperfusion injury in toll-like receptor 4-deficien tm ice[J].Circulation,2004,109:784-789.

[3] Moen SAL,Claeys M J,Timmermans JP.M yocardial ischem ia/reperfusion-inju ry,a clinical view on a complex pathophy siological process[J].In t JCardiol,2005,100(2):179-190.

[4] Frangogiannis NG,Smith CW,Entman ML.The inflamm atory response in myocardial infarction[J].Cardiovasc Res,2002,53:31-47.

[5] Calvillo L,LatiniR,Kajstu ra J,eta l.Recombinant human erythropoietin p rotects them yocardium from ischem ia-reperfusion in jury and promotesbeneficial remodeling[J].PNAS,2003,100:4802-4806.

[6] 楊簡,楊俊.Toll樣受體4在大鼠心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)的實驗研究[J].中華心血管病雜志,2008,36:57-61.

[7] K inma GT,Chun YS,Park JW,et al.Role of apoptosis-inducing factor in myocardial cell death by ischem ia-reperfusion[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,309:619.

[8] Zhu BQ,Sievers RE,Brow ne AE,et al.Comparative effects of aspirin with ACE inhibito r or angiotensin receptor blocker on myocardial infarction and vascular function[J].JRenin Angiotensin A ldosterone Syst,2003,4(1):31.