任 健，柳陳堅，李海燕

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650224)

鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci)為鸚鵡熱(Psittacosis)即鳥疫(Ornithosis)的病原體；同時，它具有廣泛的感染譜，不僅能夠感染130多種鳥類、數(shù)十種哺乳動物，也可以感染人引起相應(yīng)的各種疾病。各種動物或人由于接觸感染C.psittaci的家畜或禽鳥類的分泌物、排泄物而引起感染，該病是典型的動物源性傳染病。鳥類大多呈現(xiàn)隱性持續(xù)感染，并且主要為個體散發(fā)，但也有群體流行爆發(fā)的病例。其臨床主要表現(xiàn)為結(jié)膜炎、鼻炎及腹瀉。人感染發(fā)病時，主要表現(xiàn)為寒顫、發(fā)熱、咳嗽和胸悶等非典型性肺炎的癥狀，此時的呼吸道分泌物具有傳染性[1]。該病在20世紀(jì)30年代初有過一次大流行，由此受到廣泛關(guān)注，同時作為一種人畜共患傳染病，快速準(zhǔn)確的診斷和檢測手段對于控制該病的流行顯得尤為重要。目前我國對嗜衣原體的檢測主要停留在細(xì)胞培養(yǎng)及免疫檢驗階段，與分子生物學(xué)檢測方法相比，傳統(tǒng)檢測方法均表現(xiàn)出特異性與敏感性低，耗時長，診斷方法繁瑣，確診率低等缺陷。

1 傳統(tǒng)C.psittaci檢測方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)法 常見有兩種方法，一種是利用HeLa 229細(xì)胞或McCoy細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，另一種則是通過雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)，隨后均經(jīng)過姬姆薩染色或熒光染色，最終利用顯微鏡鑒定包涵體。細(xì)胞培養(yǎng)法由于其敏感性、特異性、陽性與陰性預(yù)期值等均相對可靠，并且重復(fù)性好等，而一直被認(rèn)為是檢測該病原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。然而，細(xì)胞培養(yǎng)法對樣品的預(yù)處理要求高，培養(yǎng)時間長，檢出率存在局限性，因此不適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

1.2 免疫檢測方法 主要包括抗體和抗原檢測。實驗室常用免疫熒光法(IFA)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)進(jìn)行抗體檢測，前者主要通過檢測經(jīng)熒光標(biāo)記的抗原與機(jī)體產(chǎn)生的相應(yīng)IgG抗體是否特異性結(jié)合，從而對機(jī)體是否感染C.psittaci做出初步判斷；而后者以免疫溶血機(jī)制作指示系統(tǒng)，利用已知的C.psittaci抗原來檢測機(jī)體內(nèi)相應(yīng)的抗體。由于年齡及感染時間等因素影響抗體的產(chǎn)生滴度，這兩種方法的檢測敏感性與特異性的再現(xiàn)性差；同時，這兩種方法還存在耗時長、操作要求高等缺陷，最終影響該疾病的診斷。此外，以C.psittaci的脂多糖(LPS)、熱休克蛋白(HSP)或主要外膜蛋白(MOMP)作為靶點，應(yīng)用直接涂抹染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光和免疫層析等抗原檢測方法也經(jīng)常應(yīng)用于嗜衣原體及衣原體的檢測。目前在畜牧業(yè)中，ELISA較為廣泛地被應(yīng)用于嗜衣原體及衣原體所引起疾病的檢測與臨床診斷中。例如針對豬衣原體而建立的Dot-ELISA檢測方法，通過與間接補(bǔ)體結(jié)合試驗(ICF)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示出該方法不僅比ICF敏感性要高，而且特異性也較強(qiáng)[2]?？乖瓩z測雖然在敏感性方面優(yōu)于抗體檢測，但是抗原蛋白特異性識別位點易發(fā)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性，最終導(dǎo)致該疾病的誤診。

總之，傳統(tǒng)檢測方法雖然相當(dāng)成熟，但是在結(jié)果判定上受主觀經(jīng)驗的影響，同時又由于有些檢測方法易出現(xiàn)交叉反應(yīng)而導(dǎo)致檢測特異性的降低，最終影響該病的臨床確診。隨著分子生物學(xué)在傳染病臨床診斷及微生物鑒定領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外學(xué)者開始探討利用分子生物學(xué)方法檢測嗜衣原體及衣原體。研究表明，分子生物學(xué)檢測體系整體展現(xiàn)出特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點，從而在病原微生物的臨床檢測方面得到廣泛應(yīng)用。

2 分子生物學(xué)檢測體系

分子生物學(xué)檢測體系是以基因檢測為基礎(chǔ)，通過對病原體特定基因的分析從而對該病原體進(jìn)行定性乃至定量分析的一種檢測體系。核酸雜交是最早應(yīng)用于衣原體診斷的分子生物學(xué)方法，其基本原理是利用標(biāo)記過的特異性探針與待測核酸按照堿基互補(bǔ)原則進(jìn)行雜交，通過對探針的檢測從而對相應(yīng)病原微生物進(jìn)行鑒定。由于該方法特異性低及敏感性弱而未得到應(yīng)用。而基于PCR原理的基因檢測技術(shù)由于特異性好、敏感性高，則逐漸成為衣原體分子生物學(xué)診斷的主流方法[3]。國外最早將PCR技術(shù)應(yīng)用于衣原體診斷，并相繼建立了以熱休克蛋白、脂多糖基因為靶基因的PCR檢測體系[4]。16S rRNA基因分析早已被應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定，上世紀(jì)80年代，Weisburg等對嗜衣原體與衣原體的16S rRNA基因進(jìn)行分析，確立了以16S rRNA為基礎(chǔ)的嗜衣原體與衣原體的鑒定體系[5]。然而由于它們的16S rRNA同源性較高，不能對種屬進(jìn)行明確地鑒定，從而無法針對該疾病進(jìn)行準(zhǔn)確有效的臨床診治。隨著對嗜衣原體及衣原體的深入研究，研究者們先后發(fā)現(xiàn)MOMP基因呈現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性，在種屬鑒定上更具有應(yīng)用價值[6-7]。主要外膜蛋白是呈感染性的原體(EB)表面的主要膜蛋白，作為一種保護(hù)性抗原可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。MOMP有4個可變區(qū)(VDs)，分別鑲嵌于5個高度保守的恒定區(qū)內(nèi)，其中血清型特異抗原決定簇位于VD1與VD2區(qū)，而種特異抗原決定簇位于VD4區(qū)，從而奠定了MOMP蛋白基因在衣原體與嗜衣原體分子生物學(xué)鑒定上的基礎(chǔ)。

3 分子生物學(xué)檢驗體系的發(fā)展

3.1 普通PCR檢測 1989年，Polland等以16S rRNA為靶基因，利用PCR方法檢測到MyCoy細(xì)胞培養(yǎng)物中的C.psittaci和沙眼衣原體(C.trachomatis)[8]。隨后，出現(xiàn)了以MOMP基因為靶基因的衣原體PCR檢測體系，該體系比Polland等構(gòu)建的檢測體系特異性高，能夠特異性鑒定出標(biāo)本中C.psittaci、沙眼衣原體和肺炎嗜衣原體(C.pneumoniae)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測方法的敏感性高于細(xì)胞培養(yǎng)法和ELISA法，然而其他兩種方法的檢測特異性明顯高于PCR法[10]。這是因為普通PCR引物單一，無法滿足在嗜衣原體及衣原體種屬鑒定上所需的特異性。而且該方法在瓊脂糖凝膠電泳過程中還存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離的效果差，主觀性和經(jīng)驗性及實驗后交叉污染等缺點，均會導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，從而影響臨床診斷，最終導(dǎo)致誤診或漏診[11]。

3.2 多重PCR檢測 多重PCR檢測是在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上克服了普通PCR引物單一所引起的檢測特異性低的缺陷改善發(fā)展而來。例如，國外以16S rRNA為靶基因，建立起了衣原體屬及C.psittaci、沙眼衣原體和肺炎衣原體種特異性多重PCR檢測體系，研究結(jié)果表明，該檢測體系對C.psittaci的陽性檢測率比細(xì)胞培養(yǎng)方法至少高一倍[12]。為進(jìn)一步提高特異性，郝永新等根據(jù)C.psittaci的rrn操縱元基因即16S-23S rRNA間隔區(qū)基因和23S rRNA基因分別設(shè)計合成2對引物用以檢測C.psittaci。該方法的特異性和敏感性均高于普通PCR法及免疫熒光檢測法[13]。套式PCR(nPCR)是利用內(nèi)外兩套引物而構(gòu)建的一種特殊的多重PCR檢測體系。糜祖煌等利用該原理構(gòu)建的16S rRNA基因nPCR檢測體系不僅能夠特異性檢測出C.psittaci菌株，而且能夠排除沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體、肺炎支原體等其它微生物的干擾。該檢測體系的靈敏度較普通PCR高100倍左右，特異性亦明顯高于普通PCR檢測方法，同時避免假陽性的出現(xiàn)，為C.psittaci的臨床診斷提供了準(zhǔn)確的檢測體系[14]。

隨著對C.psittaci的深入研究，根據(jù)表型特性、致病性和遺傳性的不同，C.psittaci被分為A、B、C、D、E、F、WC、M56及E/B等9種血清型，研究表明9種血清型與基因型均保持一致。各血清型的宿主、生理活性及致病性均存在一定差異，由此多重PCR在C.psittaci的分型及分子流行病學(xué)研究上出現(xiàn)瓶頸。隨后，改進(jìn)的RFLP-PCR分析技術(shù)在對C.psittaci進(jìn)行特異性檢測上逐漸顯現(xiàn)出其優(yōu)勢。

3.3 RFLP-PCR分析 RFLP-PCR分析即是對特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析的方法。例如根據(jù)衣原體MOMP基因的恒定區(qū)和可變區(qū)分別設(shè)計衣原體科特異性引物和種特異性引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)對相應(yīng)的衣原體菌株進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用RFLP分析該PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該體系不僅可以達(dá)到檢測與甄別衣原體的目的，而且還可以利用RFLP分析衣原體的侵襲性[15]。很多數(shù)據(jù)顯示該方法所得結(jié)果與血清型具有高度一致性，但也存在一些非一致性的結(jié)果[16-18]。最近，Laroucau等以多對基因座變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiple loci variable number of tandem repeats analysis， MLVA)[19]的 方 法 為 基礎(chǔ)，開發(fā)出一種高靈敏度、高分辨率的C.psittaci新檢測體系-MLVA系統(tǒng)[20]，為鸚鵡熱分子流行病學(xué)研究提供了一種新手段。該體系與血清學(xué)和ompA基因序列測定相比表現(xiàn)出更高的分辨率，在C.psittaci檢測及基因分型上具有優(yōu)勢。然而，該檢測體系由于不能對C.psittaci進(jìn)行定量檢測，因此有必要開發(fā)既具有高度特異性又能夠?qū)υ摬≡w進(jìn)行定量檢測的分子生物學(xué)檢測體系。由于固相捕獲技術(shù)的成熟和應(yīng)用，特別是ELISA為核酸定量提供了一個良好的實驗方法。隨后，應(yīng)用ELISA原理進(jìn)行固相捕獲的PCR-ELISA定量技術(shù)應(yīng)運而生。

3.4 PCR-ELISA PCR-ELISA是在PCR擴(kuò)增以后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來實現(xiàn)衣原體的定量檢測。使用PCR-ELISA試劑盒能夠快速地檢測出病料組織中的目的基因片段，研究結(jié)果顯示，該方法比免疫熒光抗體法特異性要高很多，卻略遜于普通PCR法[21]。由于普通PCR法缺點是需進(jìn)行凝膠電泳而容易出現(xiàn)交叉污染,從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，而PCR-ELISA法最大的優(yōu)勢在于可以很好地對檢測樣本進(jìn)行定量，其強(qiáng)陽性、弱陽性結(jié)果均容易甄別，從而適合在進(jìn)行C.psittaci的流行病學(xué)調(diào)查時應(yīng)用。雖然目前歐洲些國家已經(jīng)將PCR-ELISA試劑盒作為參考診斷試劑用于常規(guī)檢測，但是由于PCR-ELISA法在擴(kuò)增之后又要進(jìn)行ELISA反應(yīng)，而ELISA是一個開放性的反應(yīng)，很容易產(chǎn)生污染引起假陽性，最終導(dǎo)致誤診。而封閉式自動化定量基因檢測技術(shù)的快速發(fā)展為實時定量檢測衣原體提供了必要的條件。1996年由美國Applied Biosystems公司推出的實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)，不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、自動化程度更高、有效解決后PCR污染問題等特點，不失為一種首選檢測方法。

3.5 Real-time PCR Real-time PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目前運用SYBR Green標(biāo)記與TaqMan探針最為常用于Real-time PCR檢測。2005年，國外率先建立了以ompA為靶基因的Real-time PCR檢測體系，并對C.psittaci的血清型A-F及E/B進(jìn)行了種屬鑒定。該C.psittaci檢測體系不僅具有很高特異性，而且能達(dá)到10拷貝/μL的敏感性，這表明Real-time PCR在嗜衣原體與衣原體臨床檢測和診斷上將具有重要的應(yīng)用價值[22]。而在國內(nèi)，成本相較低廉的SYBR Green Real-time PCR檢測體系一直廣受青睞。我國學(xué)者成功構(gòu)建了以23S rRNA基因為靶基因SYBR Green的LightcyclerTM檢測體系，并將C.psittaci、沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體和反芻動物衣原體4種常見嗜衣原體及衣原體進(jìn)行特異性甄別并加以定量。在臨床檢測中，與傳統(tǒng)的免疫熒光組化分析相比，Real-time PCR表現(xiàn)出較高的特異性，并且其檢測敏感性能達(dá)到10-1IFU相當(dāng)?shù)乃剑沟肦eal-time PCR有望成為C.psittaci臨床檢測的一個快速、可靠的方法[23]。為提高臨床上C.psittaci鑒別診斷特異性，王爭強(qiáng)等以MOMP基因為檢測靶基因，建立具有更高特異性的SYBR Green Real-time PCR檢測體系。該體系在對C.psittaci與其他嗜衣原體、衣原體及病原體進(jìn)行鑒別診斷時表現(xiàn)出高特異性的同時，檢測敏感性超出常規(guī)PCR的100倍，其檢測限度為50拷貝/反應(yīng)[24]。由此表明，Real-time PCR在提供高特異性，高敏感性檢測的同時，還能對檢測樣品進(jìn)行定量分析，為鸚鵡熱的臨床診治及流行病學(xué)研究提供了有效的科學(xué)依據(jù)。

4 總結(jié)及展望

目前國內(nèi)的C.psittaci分子生物學(xué)檢測技術(shù)剛剛起步，準(zhǔn)確、靈敏的新型分子生物學(xué)檢測技術(shù)正日益顯現(xiàn)出優(yōu)勢。由于SYBR Green Real-time PCR方法成本低，國內(nèi)研究者大多構(gòu)建以SYBR Green為主的C.psittaci檢測體系，雖然其在C.psittaci診斷時與普通PCR相比，檢測特異性與敏感性都高，然而與TaqMan探針Real-time PCR相比，其特異性就稍顯遜色，因此進(jìn)一步開發(fā)特異性與敏感性俱佳的C.psittaci的分子生物學(xué)檢測體系就勢在必行。我們可以通過提高目的基因位點的特異性或者利用與MGB探針結(jié)合增加分析單堿基突變的能力而達(dá)到更精確鑒別的目的。同時，將多重PCR與Real-time PCR相結(jié)合，建立多重Real-time PCR檢測體系也不失為C.psittaci特異性檢測體系研究的最佳途徑。

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