黃加忠 李 靖

瘧疾是一種古老的傳染病，也是熱帶和亞熱帶地區(qū)危害最嚴重的傳染性疾病之一[1]。通過攜帶有瘧原蟲的按蚊叮咬感染人，瘧原蟲子孢子進入人體，在肝臟內(nèi)發(fā)育增殖后釋放入血，一部分被吞噬細胞吞噬，一部分侵入紅細胞內(nèi)進行裂體增殖。主要引起發(fā)熱、貧血、脾腫大及腎臟損害；在惡性瘧疾高流行地區(qū)，5歲以下兒童、孕婦、HIV患者以及無瘧疾免疫力人群易引發(fā)兇險型瘧疾，若未及時治療或處理不當，易造成部分患者死亡。目前瘧疾仍流行于100多個國家、近一半的世界人口仍然面臨感染瘧疾的危險，每年至少有3億人感染瘧疾，近300萬人死亡[2]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曾經(jīng)感染過瘧疾的個體中存在低效率和短暫性的保護性免疫，提示主動免疫可能為瘧疾的防治提供幫助[3]。自20世紀70年代以來，研究人員通過建立瘧疾感染動物模型和志愿者參與的研究發(fā)現(xiàn)，研制使用相關疫苗以預防瘧疾的發(fā)生是可行的，部分疫苗也進入臨床試驗階段?，F(xiàn)將瘧疾候選疫苗研究進展情況綜述如下。

1 紅細胞前期疫苗

瘧疾的紅細胞前期包括瘧原蟲子孢子入侵宿主并進入宿主的肝細胞，在肝細胞中進行裂體增殖而成為肝期的裂殖體。針對此階段的疫苗主要作用就是誘導宿主產(chǎn)生高水平的抗子孢子抗體，阻止子孢子進入機體：子孢子侵染肝細胞后，可誘導機體產(chǎn)生細胞免疫，由細胞毒性T淋巴細胞和其他細胞因子殺死感染的肝細胞內(nèi)子孢子，從而達到阻止子孢子侵入并且清除的目的。

1.1 射線照射減毒處理的子孢子[4]

使用經(jīng)射線照射減毒處理的子孢子對實驗動物和志愿者進行接種免疫，證明有免疫保護效果。照射減毒處理的子孢子可以正常侵染肝細胞，但不能像未經(jīng)處理的子孢子一樣進行核分裂發(fā)育成熟并繼續(xù)感染紅細胞，減毒子孢子可以存在于肝細胞內(nèi)數(shù)周至數(shù)月，此時感染的肝細胞可以誘導機體產(chǎn)生細胞免疫和抗體介導的保護性免疫，這些免疫效應物質(zhì)的靶點就是感染的肝細胞。盡管全蟲體減毒疫苗表現(xiàn)出良好的免疫原性，但是它的安全性、合適的照射劑量、疫苗的規(guī)模生產(chǎn)以及儲存等問題極難解決，接種所帶來的保護周期最長為1年[5]，這些問題使得射線照射減毒子孢子疫苗難以推廣。

1.2 遺傳性改變的瘧原蟲

Mueller等[6]采用打靶剔除瘧原蟲的UIS基因的方法，獲得減毒的紅前期瘧原蟲。研究中以伯氏瘧原蟲基因組DNA為PCR模板，擴增UIS3基因的5'和3'非編碼區(qū)域，最終在NMRI小鼠中克隆被剔除了UIS3基因的伯氏瘧原蟲，定名為UIS3（-）。在肝細胞中，子孢子向滋養(yǎng)體轉型的初期不需要UIS3基因，但滋養(yǎng)體的進一步發(fā)育以及發(fā)育到紅前期裂殖體需要UIS3基因，只有很少一部分的UIS3（-）子孢子能轉型至球形的紅前期滋養(yǎng)體，但個體小且不能發(fā)育為成熟的紅前期裂殖體。用高達10萬個UIS3（-）子孢子感染SD大鼠后，未檢出紅內(nèi)期的瘧原蟲。UIS3（-）子孢子以不同接種劑量、不同接種方式（靜脈或皮下）、不同免疫流程免疫C57BL/6小鼠，然后用野生型子孢子靜脈攻擊或感染性蚊蟲叮咬，檢測實驗小鼠的外周血原蟲血癥。所有組別的實驗結果都顯示UIS3（-）子孢子具有消除性免疫保護作用，并有很好的持久性。有的學者也采用了同樣的方法打靶踢除UIS4、P36p基因，獲得減毒子孢子，作為疫苗，也取得成功[6-8]。

1.3 紅細胞前期亞單位疫苗

1.3.1 環(huán)子孢子蛋白疫苗

Enea等[9]采用DNA重組技術克隆出環(huán)子孢子蛋白（CSP），并被確認為是有保護性的靶抗原，此項成果大大激發(fā)了研究人員的熱情，在此后的若干年中至少有20種以上的重組抗原被確認同樣具有免疫原性[10]，這些都被作為候選疫苗進行研究并取得進展。CSP蛋白是針對該期原蟲的重要靶抗原，相應的抗體可阻止子孢子的進入。CSP分子中央?yún)^(qū)域存在重復區(qū)，兩側區(qū)域是區(qū)域Ⅰ和區(qū)域Ⅱ，含有與肝細胞結合的功能域[11]。以CSP為基礎的RTS、S候選疫苗己取得了成功。RTS、S惡性瘧3D7株編碼環(huán)子孢子蛋白207～395氨基酸序列與乙型肝炎表面抗原氨基端基因融合而成，表達單一鏈的蛋白，CSP包含19個NANP重復序列及其C末端。與佐劑AS02A混合，可誘導出高水平的針對環(huán)子孢子中央重疊區(qū)的抗體，并能誘導出Thl型細胞反應。美國GSK生物公司（GSKBio）和美國陸軍醫(yī)學研究院（WRAIR）合作開展了該疫苗的臨床前和臨床試驗。Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結果顯示該疫苗在人體中是安全的，并能產(chǎn)生強免疫反應。然而，這種保護性免疫持續(xù)時間很短，當6個月后再次感染時，絕大多數(shù)自愿者已失去原有的保護力[12]。西班牙巴塞羅那大學的熱帶病專家Pedro Alonso等對94個莫桑比克鄉(xiāng)下嬰兒在10、14及18周時分別注射了RTS、S，并與對照組進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，注射了RTS、S的嬰兒患瘧疾的概率比對照組嬰兒要低65%，且不良反應并不比普通接種疫苗多[13]?？蒲腥藛T采用人工合成長肽方法產(chǎn)生了102個CSP C末端的合成肽，經(jīng)與鋁佐劑和ISA720佐劑乳化后進行Ⅰ期臨床試驗。結果顯示，該疫苗具有高免疫原性，刺激機體產(chǎn)生識別子孢子的體液免疫和細胞免疫反應。

1.3.2 ME-TRAP疫苗

該疫苗由一個多表位片段（ME）和血凝素相關黏附蛋白（TRAP）融合而成，含6種來自紅前期抗原和兩個B細胞表位。TRAP是一種跨膜蛋白，與子孢子的運動性及感染性有關。先用DNA質(zhì)粒進行初次免疫，然后用病毒載體抗原進行加強免疫，能有效的誘導T細胞免疫。Ⅰ和Ⅱa期臨床試驗顯示：部分自愿者延遲出現(xiàn)原蟲血癥，并有部分自愿者獲得保護[14]。

1.3.3 肝期抗原1 （LSA-l）

LSA-l是目前已知的惟一的肝侵染期特異性分泌蛋白，子孢子侵染肝細胞后，形成納蟲空泡內(nèi)腔。流行病學調(diào)查顯示，接觸過瘧原蟲的個體對LSA-l抗原有免疫反應。重組表達的LSA-l候選疫苗已經(jīng)進入臨床試驗的Ⅰ～Ⅱa階段，受試對象在接受瘧原蟲暴露后，免疫強化組均得到免疫保護，未出現(xiàn)延遲原蟲血癥[15]。

1.4 紅細胞前期的DNA疫苗

DNA疫苗屬于新一代疫苗，具有亞單位疫苗和全蟲疫苗的優(yōu)點，生物性質(zhì)穩(wěn)定。動物實驗中發(fā)現(xiàn)，接種DNA疫苗后，能誘導動物產(chǎn)生較高水平的特異性體液免疫和細胞免疫反應。Eric等[16]構建了一種可表達6種候選抗原的DNA疫苗，研究表明，接種此疫苗后，能產(chǎn)生針對惡性瘧原蟲的T細胞免疫。

2 紅細胞內(nèi)期候選疫苗

在此階段，由肝細胞釋放出的裂殖子侵入紅細胞，進行裂體增殖。由于大部分時間存在于紅細胞內(nèi)，只有較為短暫的時間游離于血液中與宿主免疫系統(tǒng)接觸誘導產(chǎn)生抗體依賴和細胞介導的免疫反應，因此裂殖子表面蛋白和頂端復合體抗原成為研究的焦點，多種抗原被作為候選疫苗進行研究。主要有AMA-1（頂端膜抗原1）、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4（裂殖子表面蛋白1/2/3/4）、GLURP-1（谷氨酸富含蛋白1）、RESA（環(huán)狀體感染紅細胞表面抗原）、SERA5（絲氨酸富含蛋白5）、EBA-175（紅細胞結合抗原）、EBP-2（紅細胞結合蛋白2）、RAP-2、EMP-1（惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白）以及DBL-a（Duff結合樣區(qū)域a）。

2.1 MSP-1候選疫苗

MSP-1是一前體蛋白，相對分子質(zhì)量為195×103，可分裂成4個片段，從N端至C端，依次裂解為相對分子質(zhì)量為83×103、（28～30）×103、（36～41）×103和42×103片段。第二次裂解在裂殖子侵入紅細胞前，C末端的相對分子質(zhì)量為42×103段（MSP-l42）再被裂解成相對分子質(zhì)量為33×103和19×103兩個片段，僅C末端的相對分子質(zhì)量為19×103片段（MSP-l42）隨裂殖子進入紅細胞。MSP-l42一般認為與裂殖子進入紅細胞的過程有關。用惡性瘧3D7株的MSP-142與AS02A佐劑結合，在非瘧疾流行區(qū)人群中進行的臨床試驗，顯示其有很好的安全性和較強的免疫原性。在Ⅱa攻擊試驗中，MSP-l42單獨使用或與RTS、S/AS02A聯(lián)合使用都未能顯示出其具有抗感染的保護作用?？夏醽啹懠擦餍袇^(qū)成人中Ⅰ期安全性試驗已順利完成，計劃在西肯尼亞瘧疾流行區(qū)對l～4歲兒童中進行Ⅰ期臨床試驗。

2.2 AMA-l候選疫苗

美國過敏與傳染病研究所將從惡性瘧原蟲3D7株和FVO株表達的重組蛋白等量混合，命名為AMAl-Cl，Ⅰa期臨床試驗采用的的是AMAl-C1/鋁膠佐劑，目前正在馬里采用AMA1-Cl/鋁膠佐劑+CPG7909針對成人進行Ⅰb期試驗，針對兒童的Ⅰ/Ⅱb期安全性及有效性試驗正在進行。

2.3 GLURP候選疫苗

該疫苗是惡性瘧原蟲表達的蛋白，在紅前期及紅內(nèi)期均可見。GLURP85-213核酸片段常被選擇用于合成長鏈肽，在其中包含P3抗原決定簇，可與抗體在體外試驗中表達強烈的生物學效應，Ⅰ期臨床試驗表現(xiàn)出較好的免疫原性和安全性[17]。

2.4 SERA候選疫苗

SERA候選疫苗分子量較大，可裂解成3個抗原片段，分別是相對分子質(zhì)量18×103、47×103和50×103，日本正在作基于SERA抗原的疫苗Ⅰ期試驗。

上述候選疫苗目前全部進入臨床試驗并取得階段性成果，鑒于裂殖子侵入宿主細胞過程中有多種蛋白參與，因此單一采用疫苗的保護性將很弱，甚至可能有免疫逃逸現(xiàn)象，故研究采用多種抗原混合制備疫苗，但是多種蛋白混合使用，是否會導致相互間的拮抗?因此采用基因重組表達的方式構建融合蛋白可能是形成最終疫苗的良策。上海第二軍醫(yī)大的瘧疾疫苗課題組在國內(nèi)成功構建了惡性瘧原蟲紅內(nèi)期融合蛋白PfCP-2.9，該抗原與ISA720佐劑混合后免疫實驗動物取得很好的效果，目前也正在進行臨床試驗。

3 有性生殖期候選疫苗（傳播阻斷性疫苗）

通過阻止瘧原蟲在蚊蟲體內(nèi)的有性增殖而達到阻斷瘧疾傳播的目的，在這個過程中，雖然不能使個體免于瘧疾感染，也不能減輕癥狀，但能阻斷蚊蟲將瘧原蟲從一個宿主傳播至另一個宿主，并可用于旅行者的免疫，以避免將瘧原蟲從疫區(qū)帶回，造成本地區(qū)流行的后果。目前針對此過程候選疫苗研究較少。在諸多的文獻中僅見有Hisaeda報道了Pvc25可能是間日瘧原蟲較理想的傳播阻斷疫苗候選抗原。

4 基于基因組學和蛋白質(zhì)組學的瘧疾疫苗

傳統(tǒng)的疫苗研究方法是通過生物化學、免疫學及微生物學的方法對病原體進行分析，最終獲得有效的疫苗，基因組學的疫苗設計能夠從數(shù)據(jù)庫中直接選取相關序列，預測抗原，并且這個過程不需要依賴體外培養(yǎng)病原體。1996年惡性瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫誕生，為選擇更多有效的瘧疾疫苗提供有力的幫助。蛋白質(zhì)組學的方法則可采用特定位點重組克隆技術消除了核酸內(nèi)切酶和連接酶的使用限制，提供了適合高通量過程的一些優(yōu)勢。20世紀80年代成功克隆表達了惡性瘧CSP蛋白后，在很短的時間采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)了眾多的候選疫苗。反向疫苗技術就是利用了基因組學、蛋白質(zhì)組學以及轉錄組學的信息，高通量的篩選有效保護性成分。Mu等[18]采用了基因組學技術分析了未知靶抗原蛋白多態(tài)性，并最終成功獲得新的候選疫苗。

5 結 論

瘧原蟲生活史復雜，在不同的時期表達不同的抗原，沒有主導抗原，導致瘧原蟲易逃逸宿主免疫攻擊。目前研究發(fā)現(xiàn)有近50種候選抗原，但是每一種抗原作為疫苗接種后，產(chǎn)生不了持久強大的免疫保護；動物實驗與臨床試驗的結果不一，提示瘧原蟲感染宿主后，由于宿主的種屬不同可能存在不同的免疫機制，所以需要加強瘧原蟲免疫機制的研究；在選擇疫苗時需要針對瘧原蟲的不同生活期，選用多種復合抗原，需通過基因重組的方法制備融合抗原；同時需進行免疫佐劑研究，包括一些可以增強免疫活性的細胞因子。

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