石 蕊,王玉賢,楊海瀾

近些年來,有多種的研究表明,神經(jīng)干細胞在胚胎[1]和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位比如脊髓、海馬、紋狀體[2]等都有存在,它是一群具有自我更新和多向分化潛能的細胞,它的發(fā)現(xiàn)為人們深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化以及探索治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新途徑開辟了新的思路。出生后胎兒功能健全的神經(jīng)系統(tǒng)對于胎兒、家庭和社會都具有極其重要的意義。但是胎兒在母體期間,會受到多種環(huán)境因素的影響,例如藥物[3]、病毒[4]、細菌、宮腔感染釋放的各種感染因子[5]等等,這些因素對胎兒身體,尤其是大腦發(fā)育可能會造成不可逆的影響。本研究在胚胎神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上,檢測γ干擾素(IFN-γ)這一常用炎癥因子對胚胎神經(jīng)干細胞的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用孕14 d～16 d Wistar大鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。所有的實驗操作均按照美國國家研究委員會1996年制定的“實驗動物使用和保護指南”和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物保護和使用委員會制定的“鼠類生存手術(shù)指導(dǎo)方針和政策”執(zhí)行。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng) 取孕16 d胚齡的SD大鼠,經(jīng)乙醚麻醉,常規(guī)消毒后取其胚胎,于顯微手術(shù)鏡(Lecia)下剝離大腦半球及脊髓組織,分別置于L15培養(yǎng)液(GIBcoBRL公司)中,吹打成細胞懸液。收集細胞懸液過尼龍篩網(wǎng)后,離心并重懸于無血清的神經(jīng)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液DFNG(DMEM/F12培養(yǎng)液、N2、谷氨酰胺,GIBcoBRL公司)中,按1×105/mL密度種瓶,同時添加堿性成纖維生長因子(bFGF,GIBcoBRL公司)和表皮生長因子(EGF,Sigma公司,終濃度均為20 μ g/L),于 5%CO2,37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 神經(jīng)干細胞的分化 神經(jīng)干細胞分化實驗時,將分散的單個細胞種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)蓋玻片上,接種密度為每片種5萬個活細胞。分化培養(yǎng)液為DFNGH添加1%FBS,(fetal bovine serum,GibcoBRL公司),每3 d換液一次。于接種后第6天用于免疫組化染色。IFN-γ處理組的細胞加入IFN-γ(200 U/mL)至分化培養(yǎng)液中孵育。

1.2.3 免疫組化 取切片回復(fù)至室溫,10mmol/LPBS(pH 7.4)水化10 min。神經(jīng)干細胞鑒定時,切片用含0.3%Triton X-100的1×PBS預(yù)滲透15min,然后用含10%正常山羊血清或正常驢血清的0.3%Triton X-100-PBS/PBS室溫封閉1 h。加適當(dāng)稀釋度的一抗4℃孵育過夜。一抗包括:小鼠抗大鼠Nestin單抗(IgG1,BD Pharmingen公司),用于鑒定神經(jīng)干細胞;兔抗βⅢ-tubulin多抗(Covance Research Products公司),用于鑒定神經(jīng)元;兔抗GFAP多抗(Sigma公司),用于鑒定星型膠質(zhì)細胞;小鼠抗 RIP單抗(IgG3,Chemicon公司),用于鑒定少突膠質(zhì)細胞。切片最后用 PBS洗 3次(每次10 min),然后用含有Hoechst33342(Sigma公司,用于染核)的Gel/Mount aqueous(Biomeda公司)封片后,置 Olympus BX60熒光顯微鏡下鏡檢。

1.2.4 流式細胞術(shù) 將經(jīng)吹打分散的單個細胞重懸于冰浴的PFN(PBS/2%FCS/0.1%Nazide)溶液中,與FITC標(biāo)記的抗MHC-I類分子抗體(OX-18)或抗MHC-Ⅱ類分子抗體(OX-6,Serotec公司)于4℃孵育30 min。然后細胞用冷的PFN洗兩次,冰丙酮固定10 min后重懸于PFN中立即上FACS Calibur(BD Biosciences,Mountain View,CA)分析。每個樣本分析1萬個細胞。通過前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)設(shè)門,去除細胞碎片。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)干細胞的鑒定 取孕16 d胚齡的Wistar大鼠,分離其前腦胚胎神經(jīng)干細胞,在無血清的神經(jīng)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液DFNG中,按1×105/mL密度種瓶,同時添加堿性成纖維生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF),促使其增殖,經(jīng)過 3 d～4 d能夠形成較大的神經(jīng)球,此時可以進行凍存或者傳代。對神經(jīng)球切片,進行免疫熒光分析表明,90%以上的神經(jīng)干細胞都是Nestin陽性的細胞。神經(jīng)干細胞分化實驗時,將分散的單個細胞種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)蓋玻片上,接種密度為每片種5萬個活細胞。分化培養(yǎng)液為DFNGH添加1%FBS,撤去bFGF和 EGF并且添加FBS,是為了促進分化,每3 d換液1次,于接種后第6天用于免疫組化染色。染色結(jié)果表明,體外培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞能夠分化成β-tubulinⅢ陽性的神經(jīng)元、Rip陽性的少突膠質(zhì)細胞和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞。

2.2 IFN-γ影響神經(jīng)干細胞的生長狀態(tài) 采用20 U/mL、200 U/mL和2 000 U/mL IFN-γ對神經(jīng)干細胞進行刺激。在傳代后1 d加入不同濃度的IFN-γ,刺激1 d后,神經(jīng)干細胞呈現(xiàn)出不同的生長狀態(tài)。可以明顯地看出,隨著濃度的增高,神經(jīng)干細胞逐漸喪失了成球生長的特性,而逐漸貼壁,伸出大量突起;胚胎神經(jīng)干細胞:從形態(tài)上可以發(fā)現(xiàn),沒有加入IFN-γ的神經(jīng)干細胞保持了強大的增殖能力,但隨著IFN-γ濃度的增加,神經(jīng)干細胞的增殖能力逐漸減弱,而成球生長的能力喪失,傾向于貼壁生長,伸出較多突起。4倍鏡下。經(jīng)過3d的培養(yǎng),發(fā)現(xiàn),2 000 U/mL IFN-γ的濃度對神經(jīng)干細胞生長有明顯的毒性作用。培養(yǎng)瓶中細胞大量死亡,而其他濃度細胞未見明顯死亡。接著,取 4種 IFN-γ刺激濃度(0、20 U/mL、200 U/mL、2 000 U/mL)的細胞上清進行LDH毒性測試,也證實了這個結(jié)論。

2.3 IFN-γ促進神經(jīng)干細胞MHC分子的表達 采用流式細胞術(shù),針對大鼠M HCⅠ類和Ⅱ類分子的相應(yīng)抗體OX-18和OX-6,對刺激2 d的神經(jīng)干細胞進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞既表達MHCⅠ類分子,也表達M HCⅡ類分子,但表達量很低。但是,經(jīng)過炎性因子IFN-γ刺激以后,神經(jīng)干細胞MHCⅠ類和Ⅱ類分子的表達顯著上調(diào)。

3 討 論

在孕期胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是胎兒發(fā)育中重要的一環(huán),在這個過程中胎兒生長環(huán)境的任何變化,都可能導(dǎo)致胎兒發(fā)育的異常。神經(jīng)干細胞是神經(jīng)發(fā)育的起始細胞,由干細胞發(fā)育而來,具有自我復(fù)制和多向分化的潛能,能夠分化成神經(jīng)元,少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,是神經(jīng)發(fā)育的重要細胞。IFN-γ是一種重要的炎性介質(zhì),在病毒感染,細菌感染等疾病中大量分泌,但是IFN-γ是否會影響神經(jīng)干細胞的生長狀態(tài),對神經(jīng)干細胞有怎樣的影響呢?

在本研究中,建立了大鼠神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)模型,在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),IFN-γ在高濃度情況下,對神經(jīng)干細胞具有顯著的毒性作用,在中等劑量下,會促進孕期胚胎神經(jīng)干細胞的MHC的表達。由于MHC作為主要組織相容性抗原,在器官排斥中起重要作用,它的表達上調(diào),推測IFN-γ可能在胎兒發(fā)育過程中起到非常重要的作用。大劑量IFN-γ對神經(jīng)干細胞具有毒性作用,其毒性具有劑量依賴作用,提示嚴重的感染或者疾病,產(chǎn)生的炎性因子可能直接對胎兒產(chǎn)生不利影響。

關(guān)于神經(jīng)干細胞是否表達MHC分子,近些年才有一些報道,但是由于采用的種屬和細胞培養(yǎng)方法不同,結(jié)果也有一些不同。McLaren[6]報道大鼠的神經(jīng)干細胞低水平,表達了MHCⅠ類分子但不表達M HCⅡ類分子,而Sun等[7]發(fā)現(xiàn),IFN-γ能夠在早期妊娠增加非經(jīng)典的MHCⅡ類抗原RT1-DM和經(jīng)典的MHC I類抗原RT1-A的表達,而在妊娠中期降低它們的表達。在晚期妊娠,胎盤RT1-A的表達降低,在子宮中升高,而RT1-DM在子宮和胎盤中都升高。本研究結(jié)果顯示,正常細胞培養(yǎng)情況下,大鼠的神經(jīng)干細胞低水平的表達MHC抗原,但是IFN-γ能夠顯著上調(diào)其表達。MHC作為一種主要的移植抗原,表達的上調(diào)意味著胎兒被排斥風(fēng)險的增加,以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的機會增大。從另外一方面講,MHC是否參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程,也是值得關(guān)注的一個問題。

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[2]Conti L,Reitano E,Cattaneo E.Neural stem cell systems:Diversities and properties after transplantation in animal models of diseases[J].Brain Pathol,2006,16:143-154.

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