苗明珠 綜述 孫麗洲 審校

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210036）

非整倍體異常是人類最常見的一類染色體數(shù)目異常，其中最常見的為三體征，常見染色體三體綜合征的發(fā)病率為1∶400［1］。最常見的非整倍體異常發(fā)生在21、18、13號(hào)常染色體及X，Y性染色體。這些異常主要包括21-三體綜合征（唐氏綜合征）、18-三體綜合征（Edward綜合征）、13-三體綜合征（Patau綜合 征）、45XO（Turner 綜 合 征）、47XXY（Klinefelter綜合征），約占產(chǎn)前診斷中有臨床意義的染色體異常的80%［2，3］。因此，做好對(duì)胎兒非整倍體的檢測(cè)一直是產(chǎn)前診斷的重要部分。

傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法為細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析，是診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)。方法是對(duì)羊膜腔穿刺獲得的羊水細(xì)胞或絨毛抽吸獲得的絨毛細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)染色體有絲分裂期的核分裂相進(jìn)行分析。對(duì)所有的23對(duì)染色體都進(jìn)行檢查，可以檢出包括染色體數(shù)目異常和染色體重排等結(jié)構(gòu)異常在內(nèi)的多種染色體異常，例如平衡或不平衡的染色體易位和染色體倒位。盡管核型分析為最有效的產(chǎn)前診斷方法，但是該方法需要高質(zhì)量的專業(yè)人員且非常耗時(shí)，其結(jié)果報(bào)道的時(shí)間大約為10～14天［4］。據(jù)報(bào)道，在英國每20個(gè)孕婦就有一個(gè)需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷［5］。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法在產(chǎn)前診斷的發(fā)展中已受到限制，尋找快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷方法已成為當(dāng)今產(chǎn)前診斷的研究熱點(diǎn)。對(duì)于我國這樣一個(gè)人口大國來講，尋求更快、更簡便的產(chǎn)前診斷方法更加重要及必需。目前我國進(jìn)行產(chǎn)前診斷的指征主要有：高齡孕婦（≥35歲）、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲探測(cè)的胎兒異常及父母一方或雙方有染色體異常的家族史。近年來，隨著高齡產(chǎn)婦的增加，以及孕婦外周血清學(xué)篩查的開展和超聲技術(shù)的發(fā)展，需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦數(shù)量逐年增加［5］，因此，很有必要建立快速、簡便的非整倍體診斷方法應(yīng)用于臨床。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為尋求新的產(chǎn)前診斷技術(shù)提供了基礎(chǔ)。一些分子診斷技術(shù)已用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，可做到快速診斷，通常在24～48小時(shí)內(nèi)即可得到結(jié)果［1］。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）就是一種迅速發(fā)展的可用于快速產(chǎn)前診斷的分子生物學(xué)方法。1992年，日本人 Higuchi發(fā)明了該技術(shù)［6］。QFPCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法［6］。1993年Mansfield ES［7］首次報(bào)道了基于短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）的 QF-PCR 產(chǎn)前診斷技術(shù)，至今已經(jīng)歷了近20年的發(fā)展。本文著重對(duì)QF-PCR在產(chǎn)前診斷非整倍體中的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 QF-PCR原理及背景

自從1983年Mullis發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）以來，PCR技術(shù)作為一種重要的基因診斷方法，以其迅速、簡便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)很快成為科研、臨床診斷的熱點(diǎn)技術(shù)。但是傳統(tǒng)PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量。為克服上述不足，人們采取了許多方法，如雜交法、酶聯(lián)法及尿苷酶降解法等，但均不能得到滿意的結(jié)果。直到1992年，日本人Higuchi［6］發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該問題才逐步得到改善。他在原有的普通PCR儀的基礎(chǔ)上，加以改進(jìn)，添加一個(gè)激發(fā)和檢測(cè)裝置，并通過在PCR反應(yīng)液中添加染料溴化乙錠（EB）的方法，來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)的全過程。隨著新的熒光染料和熒光標(biāo)記探針的引入以及QF-PCR高靈敏度、高特異性和高精確性的特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

2 QF-PCR在非整倍體產(chǎn)前診斷中的發(fā)展

QF-PCR技術(shù)首次用于非整倍體的產(chǎn)前診斷源于1993年，Mansfield［7］應(yīng)用基于STR的 QF-PCR技術(shù)診斷了21三體、18三體及X染色體數(shù)目異常。STR，是多型性的一種類型，指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸重復(fù)排列，且不同的重復(fù)序列相鄰的形式，長度約2～10個(gè)堿基對(duì)，常見于非編碼的內(nèi)含子中。由于重復(fù)單位及重復(fù)次數(shù)不同，使其在不同種族、不同人群之間的分布具有很大差異性，構(gòu)成了STR遺傳多態(tài)性。不同個(gè)體之間在一個(gè)同源STR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)不同，由此可應(yīng)用基于STR的等位基因比判斷感興趣的染色體的拷貝數(shù)。Mansfield用于診斷的STR分別為21號(hào)染色體的D21S11，18號(hào)染色體的MBP的5’端的2個(gè)STR、X染色體的HPRT等。1994年，Pertl等應(yīng)用相同的STR——D21S11，對(duì)134例樣本進(jìn)行了診斷。除了2例無法判斷，其余正常樣本均顯示雙等位基因比接近1∶1，21三體樣本顯示為1∶1∶1的三等位基因比或2∶1的雙等位基因比［8］。當(dāng)一種染色體只應(yīng)用一個(gè)STR時(shí)，如果兩條同源染色體的STR相同，即為純合，就無法判斷該染色體的拷貝數(shù)。為了克服上述問題，在接下來的一系列研究中一些學(xué)者逐漸對(duì)一種染色體應(yīng)用幾個(gè)STR，以提高雜合覆蓋率，進(jìn)而減少無法判斷的情況［9，10］。經(jīng)歷了近20年的發(fā)展，現(xiàn)在用于常見非整倍體診斷的STR，英國臨床細(xì)胞遺傳學(xué)協(xié)會(huì)（Association of Clinical Cytogenetics，ACC）已于2007年做了明確規(guī)定。

除了上述幾種非整倍體異常的診斷方法，1998年13三體綜合征也應(yīng)用QF-PCR的方法首次成功診斷［11］。于是，QF-PCR在非整倍體的產(chǎn)前診斷中主要應(yīng)用于21、18、13、X、Y幾種常見染色體異常的診斷。在QF-PCR首次報(bào)道用于非整倍體的產(chǎn)前診斷后，接下來的研究主要集中于其在幾種常見非整倍體異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用及單細(xì)胞方面［8，9，12］，并未對(duì)該方法的靈敏度及特異性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。直到2001年，一些大樣本的研究才開始對(duì)QF-PCR的靈敏度及特異性進(jìn)行考察［13，14］。一系列的研究證實(shí)，QF-PCR對(duì)于非嵌合的非整倍體診斷的靈敏度和特異性均在90%以上［15-20］。在歐洲一些實(shí)驗(yàn)室，QF-PCR已取代其他非整倍體快速產(chǎn)前診斷（rapid aneuploidy detection，RAD）方法，作為核型分析的一種輔助手段用于非整倍體的快速產(chǎn)前診斷。

3 QF-PCR用于非整倍體產(chǎn)前診斷的特點(diǎn)

3.1 優(yōu)點(diǎn)

3.1.1 所需樣本量小、取樣孕周要求低 QF-PCR用于產(chǎn)前診斷所用的樣本可以是羊水、絨毛、胎兒血或胎兒組織，目前最常用的為羊水和絨毛。傳統(tǒng)的核型分析需要20mL的羊水，F(xiàn)ISH需要5～10ml的羊水。用于QF-PCR的DNA可以從很少量的羊水中提取，文獻(xiàn)中報(bào)道的用量為0.5～5ml［21-25］，最多見的用量還是1～2ml［23］。其他樣本的用量為胎兒血5μL，1～2mm厚的胎兒組織層等［20］。用于PCR擴(kuò)增的DNA主要提取自細(xì)胞，因此不要求細(xì)胞必須是未受損的或是活細(xì)胞。這就使該方法對(duì)樣本的取樣孕周無特定要求，可早在12周，或晚期34周時(shí)進(jìn)行取樣，此時(shí)細(xì)胞活性對(duì)結(jié)果的可靠性沒有影響［13］。

3.1.2 快速 現(xiàn)在已認(rèn)識(shí)到孕婦在等待核型分析結(jié)果的這段長時(shí)間內(nèi)，心理上處于一種焦慮狀態(tài)［5］，對(duì)胎兒也會(huì)造成不良影響。因此減少等待時(shí)間、緩解焦慮也是RAD被應(yīng)用的一個(gè)主要原因。QFPCR在獲取樣本后24～48小時(shí)即可獲得診斷報(bào)告，可顯著減少孕婦的等待時(shí)間［18］。如果結(jié)果正常，可早期緩解孕婦及家庭的焦慮；如果結(jié)果不正常，可繼續(xù)等待核型分析的結(jié)果，也可即時(shí)采取終止妊娠等處理措施。

3.1.3 自動(dòng)化程度高 傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析需要大量的人力，技術(shù)水平要求高，需要專業(yè)人員。一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的工作人員每年最多也只能完成250例核型分析［26］。而現(xiàn)在，在一個(gè)有DNA測(cè)序儀的實(shí)驗(yàn)室條件下，每次每臺(tái)儀器可完成90份樣本的檢測(cè)［13］，甚至有的實(shí)驗(yàn)室每次可完成96例［27］。QF-PCR可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，一個(gè)工作人員可完成的檢測(cè)量明顯多于核型分析。因此，每天可進(jìn)行大量患者樣本的檢測(cè)。

3.1.4 可檢出母體細(xì)胞污染的樣本 母體細(xì)胞污染主要發(fā)生于侵入性產(chǎn)前診斷取樣過程中。肉眼可見的母血細(xì)胞污染的樣本，我們?cè)谔幚頃r(shí)不難發(fā)現(xiàn)，但是對(duì)于一些肉眼無法辨別的污染樣本，在進(jìn)行核型分析或FISH檢測(cè)時(shí)則會(huì)遇到一定的問題。當(dāng)胎兒性別為男性時(shí)，母體細(xì)胞污染容易檢出，但當(dāng)胎兒為女性時(shí)，母體和胎兒混雜的細(xì)胞則無法分辨。在對(duì)母體細(xì)胞污染的樣本進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)兩種基因型，此時(shí)可獲取母體樣本進(jìn)行擴(kuò)增，與用于產(chǎn)前診斷的樣本進(jìn)行仔細(xì)比較，可確定母體細(xì)胞的污染，但不能對(duì)欲進(jìn)行診斷的樣本做出染色體情況的診斷［22，28］。

3.1.5 成本-效益 與細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析不同，QF-PCR不需要細(xì)胞培養(yǎng)，也不需要FISH操作時(shí)復(fù)雜的處理程序及人力的消耗，因此其費(fèi)用相對(duì)較低［5，13，17，21，23，28］。對(duì)我國的國情來說，也是一種可行的方法。

3.2 缺點(diǎn)

3.2.1 只能用于常見染色體異常 QF-PCR現(xiàn)在所用的STRs主要是針對(duì)21、18、13、X、Y等常見染色體的標(biāo)記物，因此該方法目前只能用于這五類常見染色體數(shù)目異常的檢測(cè)［13］。對(duì)于其他目前仍沒有STRs標(biāo)記物的染色體，現(xiàn)在還無法檢測(cè)。

3.2.2 對(duì)嵌合體的檢出還不是很靈敏 QF-PCR已被證實(shí)為可靠的、有效的用于診斷主要的三體征的方法，對(duì)于非嵌合體樣本沒有假陽性和假陰性的結(jié)果［16］。Celia Donaghue等［29］通過實(shí)驗(yàn)評(píng)估了QF-PCR對(duì)嵌合體的檢出效力，并對(duì)檢出結(jié)果與核型分析結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行了分析，所得出的結(jié)論是當(dāng)異常細(xì)胞占整個(gè)樣本至少15%時(shí)，QF-PCR可對(duì)其嵌合狀態(tài)做出診斷。也就是說，QF-PCR并不能對(duì)所有嵌合狀態(tài)做出診斷，只有異常細(xì)胞達(dá)到一定比例時(shí)，才能做出診斷。

4 QF-PCR在非整倍體產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

QF-PCR在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，仍存在一定的爭議。盡管所有報(bào)道都認(rèn)為QF-PCR是一種經(jīng)濟(jì)且快速的診斷技術(shù)，但對(duì)其準(zhǔn)確性卻持有不同的觀點(diǎn)。一些學(xué)者認(rèn)為，QF-PCR可作為傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)的一種輔助手段［9，13，30］。也有學(xué)者認(rèn)為，如果將來胎兒細(xì)胞能從母體外周血中分離得到，QF-PCR可作為產(chǎn)前診斷非整倍體的一種不錯(cuò)的選擇［10］，因?yàn)镼F-PCR的應(yīng)用僅需很小的樣本量，有報(bào)道最少可用10個(gè)細(xì)胞［31］。而Mann等［32］卻持有不同的觀點(diǎn)，他提倡個(gè)體化的產(chǎn)前診斷方案，即產(chǎn)前超聲異?；蚋改溉旧w異常者，建議核型分析；高齡孕婦或母體血清學(xué)篩查陽性者，可只進(jìn)行QF-PCR診斷。近幾年，Ogilvie和Leung［33，34］建議用QF-PCR取代傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析，他們認(rèn)為該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)明顯大于缺點(diǎn)。

QF-PCR在非整倍體快速產(chǎn)前診斷中的研究主要在英國等一些歐 洲國家［20，25，35，36］，也有一些在亞洲人群中的研究［22，24，37］，而在美國的研究報(bào)道則很少［38］。英國從2007年開始已將QF-PCR作為非整倍體診斷的一種獨(dú)立方法，而不再作為核型分析的一種輔助手段。且英國ACC也于2007年底發(fā)布了QF-PCR用于非整體產(chǎn)前診斷的實(shí)踐指南，使其在此領(lǐng)域的應(yīng)用更加規(guī)范化。關(guān)于QF-PCR在國內(nèi)非整倍體產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的報(bào)道不是很多［22，37］。由于大部分這方面的研究都以國外人群作為研究對(duì)象，且STR的遺傳多態(tài)性在不同人群與不同種族之間的分布具有很大差異性，所以直接將國外研究的STR應(yīng)用于國內(nèi)人群的靈敏度與特異性還有待考察。中國應(yīng)用QF-PCR于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，目前主要應(yīng)基于國內(nèi)人群的STR雜合率覆蓋的研究，以選取合適的STR標(biāo)記用于國內(nèi)人群的非整倍體診斷。

經(jīng)歷了近20年的發(fā)展，QF-PCR在英國已作為獨(dú)立檢測(cè)手段應(yīng)用于臨床。隨著此技術(shù)在非整倍體產(chǎn)前診斷中的逐漸應(yīng)用，相應(yīng)的商品化試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生。目前用的最廣泛的試劑為ANEUFAST Multiplex QF-PCR Kit，與Chromoquant Version 2kit相比，該試劑盒的數(shù)據(jù)采集與結(jié)果分析都更加容易。

5 QF-PCR在非整倍體產(chǎn)前診斷中的展望

QF-PCR作為快速產(chǎn)前診斷的一種分子生物學(xué)方法，給現(xiàn)在的產(chǎn)前診斷帶來了巨大的發(fā)展前景。但其是否可以取代核型分析，作為一種最具成本-效益的單獨(dú)測(cè)試手段仍存在很大的爭議。在將來希望能將其與母血中游離胎兒核酸的非侵入性檢測(cè)手段結(jié)合起來，進(jìn)行胎兒染色體異常的診斷。相信隨著QF-PCR方法的不斷發(fā)展與成熟，QF-PCR將發(fā)揮越來越大的作用。

［1］ De Vigan C，Baena N，Cariati E，et al.Contribution of ultrasonographic examination to the prenatal detection of chromosomal abnormalities in 19centres across Europe［J］.Ann Genet，2001，44（4）：209-217.

［2］ Stumm M，Wegner RD，Bloechle M，et al.Interphase MFISH applications using commercial probes in prenatal and PGD diagnostics［J］.Cytogenet Genome Res，2006，114：296-301.

［3］ Shaffer LG，Bui TH.Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2007，145C（1）：87-98.

［4］ Liehr T，Ziegler M.Rapid prenatal diagnostics in the interphase nucleus：procedure and cut-off rates［J］.J Histochem Cytochem，2005，53（3）：289-291.

［5］ Hulten MA，Dhanjal S，Pertl B.Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders：advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR［J］.Reproduction，2003，126（3）：279-297.

［6］ Higuchi R，Dollinger G，Walsh PS，et al.Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences［J］.Biotechnology，1992，10（4）：413-417.

［7］ Mansfield ES.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms［J］.Hum Mol Genet，1993，2（1）：43-50.

［8］ Pertl B，Yau SC，Sherlock J，et al.Rapid molecular method for prenatal detection of Down's syndrome［J］.Lancet，1994，343（8907）：1197-1198.

［9］ Pertl B，Weitgasser U，Kopp S，et al.Rapid detection of trisomies 21and 18and sexing by quantitative fluorescent multiplex PCR［J］.Hum Genet，1996，98（1）：55-59.

［10］ Verma L，Macdonald F，Leedham P，et al.Rapid and simple prenatal DNA diagnosis of Down's syndrome［J］.Lancet，1998，352（9121）：9-12.

［11］ Toth T，F(xiàn)indlay I，Papp C，et al.Prenatal detection of trisomy 13from amniotic fluid by quantitative fluorescent polymerase chain reaction［J］.Prenat Diagn，1998，18（7）：669-674.

［12］ Sherlock J，Cirigliano V，Petrou M，et al.Assessment of diagnostic quantitative fluorescent multiplex polymerase chain reaction assays performed on single cells［J］.Ann Hum Genet，1998，62：9-23.

［13］ Levett LJ，Liddle S，Meredith R.A large-scale evaluation of amnio-PCR for the rapid prenatal diagnosis of fetal trisomy［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2001，17（2）：115-118.

［14］ Cirigliano V，Ejarque M，Canadas MP，et al.Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction（QF-PCR）for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies［J］.Mol Hum Reprod，2001，7（10）：1001-1006.

［15］ Yoon HR，Park YS，Kim YK.Rapid prenatal detection of down and edwards syndromes by fluorescent polymerase chain reaction with short tandem repeat markers［J］.Yonsei Med J，2002，43（5）：557-566.

［16］ Mann K，Donaghue C，F(xiàn)ox SP，et al.Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy［J］.Eur J Hum Genet，2004，12（11）：907-915.

［17］ Cirigliano V，Voglino G，Canadas MP，et al.Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR.Assessment on 18，000consecutive clinical samples［J］.Mol Hum Reprod，2004，10（11）：839-846.

［18］ Ogilvie CM，Donaghue C，F(xiàn)ox SP，et al.Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy using quantitative fluorescence-PCR（QF-PCR）［J］.J Histochem Cytochem，2005，53（3）：285-288.

［19］ Cirigliano V，Voglino G，Marongiu A，et al.Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR：evaluation of 30，000consecutive clinical samples and future applications［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1075：288-298.

［20］ Cirigliano V，Voglino G，Ordonez E，et al.Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR，results of 9years of clinical experience［J］.Prenat Diagn，2009，29（1）：40-49.

［21］ Cirigliano V，Canadas P，Plaja A，et al.Rapid prenatal diagnosis of aneuploidies and zygosity in multiple pregnancies by amniocentesis with single insertion of the needle and quantitative fluorescent PCR［J］.Prenat Diagn，2003，23（8）：629-633.

［22］ Liao C，Yang X，Li FT，et al.The detection of aneuploidy and maternal contamination by QF-PCR in samples undergoing prenatal diagnosis for thalassemia in Southern China［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2009，144（2）：149-152.

［23］ Rahil H，Solassol J，Philippe C，et al.Rapid detection of common autosomal aneuploidies by quantitative fluorescent PCR on uncultured amniocytes［J］.Eur J Hum Genet，2002，10（8）：462-466.

［24］ Cho EH，Park BY，Kang YS，et al.Validation of QF-PCR in a Korean population［J］.Prenat Diagn，2009，29（3）：213-216.

［25］ Putzova M，Pecnova L，Dvorakova L，et al.OmniPlex--a new QF-PCR assay for prenatal diagnosis of common aneuploidies based on evaluation of the heterozygosity of short tandem repeat loci in the Czech population［J］.Prenat Diagn，2008，28（13）：1214-1220.

［26］ Kagan KO，Chitty LS，Cicero S，et al.Ultrasound findings before amniocentesis in selecting the method of analysing the sample［J］.Prenat Diagn，2007，27（1）：34-39.

［27］ Baart EB， Martini E， Van Opstal D.Screening for aneuploidies of ten different chromosomes in two rounds of FISH：a short and reliable protocol［J］.Prenat Diagn，2004，24（12）：955-961.

［28］ Ramsden SC，Mann K，Mcconnell C，et al.External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques：3years experience［J］.Prenat Diagn，2007，27（5）：404-408.

［29］ Donaghue C，Mann K，Docherty Z，et al.Detection of mosaicism for primary trisomies in prenatal samples by QFPCR and karyotype analysis［J］.Prenat Diagn，2005，25（1）：65-72.

［30］ Bili C，Divane A，Apessos A，et al.Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR［J］.Prenat Diagn，2002，22（5）：360-365.

［31］ Tutschek B，Sherlock J，Halder A，et al.Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation：molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy［J］.Prenat Diagn，1995，15（10）：951-960.

［32］ Mann K，F(xiàn)ox SP，Abbs SJ，et al.Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis［J］.Lancet，2001，358（9287）：1057-1061.

［33］ Ogilvie CM.Prenatal diagnosis for chromosome abnormalities：past，present and future［J］.Pathol Biol（Paris），2003，51（3）：156-160.

［34］ Leung WC，Lau ET，Lao TT，et al.Rapid aneuploidy screening（FISH or QF-PCR）：the changing scene in prenatal diagnosis［J］.Expert Rev Mol Diagn，2004，4（3）：333-337.

［35］ Onay H，Ugurlu T，Aykut A，et al.Rapid prenatal diagnosis of common aneuploidies in amniotic fluid using quantitative fluorescent polymerase chain reaction ［J］.Gynecol Obstet Invest，2008，66（2）：104-110.

［36］ Putzova M，Soldatova I，Pecnova L，et al.QF-PCR-based prenatal detection of common aneuploidies in the Czech population：five years of experience［J］.Eur J Med Genet，2008，51（3）：209-218.

［37］ Sun X，Yan M，Zhang Y，et al.Practical application of fluorescent quantitative PCR on Trisomy 21in Chinese Han population［J］.Mol Biol Rep，2006，33（3）：167-173.

［38］ Brown L，Abigania M，Warburton D，et al.Validation of QF-PCR for prenatal aneuploidy screening in the United States［J］.Prenat Diagn，2006，26（11）：1068-1074.