孫穎楨， 陳科力， 劉 震

(1.省部共建中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點實驗室;湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065;2.紫瑯職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，江蘇南通226002)

江南卷柏是卷柏科植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的全草，用于治療各種疾病出血、血小板減少癥，以及急性黃疸型傳染性肝炎等多種疾?。?］?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》將其作為石上柏的原植物之一收載，用于癌癥及多種炎癥的治療［2］。江南卷柏所含的化學(xué)成分主要為雙黃酮類，包括穗花杉雙黃酮、雞毛松雙黃酮A和B、4′－甲醚－羅波斯塔雙黃酮、羅波斯塔雙黃酮、扁柏雙黃酮等，還含有3種黃酮苷類［3，4］，其中穗花杉雙黃酮的含量較高。黃酮類具有抗炎、抗氧化的作用，穗花杉雙黃酮具有抗腫瘤，抗病毒，血管舒張作用［5］，因此，總黃酮是江南卷柏的主要活性部位。炎癥與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)［6］，環(huán)氧化酶－2(COX－2)是炎癥介質(zhì)分子前列腺素合成關(guān)鍵的限速酶，它在腫瘤組織中的高度表達(dá)，使它成為抗癌藥研究的一個重要的靶點［7］。COX－2可反映在蛋白質(zhì)水平及mRNA水平上，本實驗考察江南卷柏總黃酮對COX－2 mRNA水平的調(diào)節(jié)作用，探討江南卷柏總黃酮可能的抗腫瘤作用及其機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞系

結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞系，購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。培養(yǎng)液為RPMI－1640加10%新生牛血清、100 ng/mL的青霉素和鏈霉素，常規(guī)條件培養(yǎng)(5%CO2，37℃，下同)。

1.2 儀器及試劑

潔凈工作臺 (上海博迅);倒置顯微鏡 (OLYMPUS);CO2培養(yǎng)箱 (Sheldon);紫外檢測儀(Hitachi U－2001日立公司);基因擴(kuò)增儀(Biometra德國);電泳儀(DYY－8C北京);凝膠成像分析儀(WD－9413A北京);新生牛血清(武漢三利);RPMI－1640(Sigma);DMSO(Amresco);oligodT18、Rnasin(上海捷瑞);BIOZOL裂解液、DEPC、Marker等(北京天根);引物均由上海生工合成。

1.3 材料和藥物樣品

江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron.系蕨類卷柏科卷柏屬Selaginella植物，于2004年8月采集于湖北宜昌霧渡河，原植物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定，標(biāo)本留存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。江南卷柏總黃酮為本實驗室按文獻(xiàn)從江南卷柏中提取制備［8］，江南卷柏總黃酮中黃酮類成分的含量大于50%，其中穗花衫雙黃酮含量為40%以上。江南卷柏總黃酮用DMSO溶解制得100 mg/mL的樣品貯備液。

2 方法

2.1 藥物對細(xì)胞生長的抑制作用

采用氮藍(lán)四唑鹽實驗(MTT法)，取對數(shù)生長期細(xì)胞稀釋至5×105/mL，接種于96孔板，200 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄取原培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的樣品貯備液，使其終濃度分別為 100、50、25、12.5 μg/mL，對照組加同體積培養(yǎng)液，每組設(shè)4復(fù)孔，設(shè)3個時間梯度24 h、48 h、72 h，藥物作用結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，加入 MTT 5 mg/mL，20 μL/孔，37 ℃孵育 4 h，加入 DMSO 150 μl/孔，震蕩溶解 10 min，570 nm 測各孔吸光度。實驗重復(fù)3次，取均值。分別計算抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50(抑制一半細(xì)胞生長所需的藥物濃度)。抑制率=(1—A給藥孔/A對照孔)×100%。

2.2 RT－PCR 法檢測藥物對 HT－29 細(xì)胞 COX－2mRNA 表達(dá)的影響

將對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29細(xì)胞接種至6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入樣品貯備液使其終濃度分別為:40 μg/mL(高劑量組)、20 μg/mL(中劑量組)、10 μg/mL(低劑量組)、0 μg/mL(陰性對照組)，培養(yǎng)24 h。藥物作用后，用BIOZOL裂解提取RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。用微量比色皿在紫外下檢測RNA的純度及濃度，并將各組總RNA濃度調(diào)整至同一水平。各組取等量RNA 加入 1 μL oligodT18，Rnasin 1 μL，dNTP 1 μL，MLV 1 μL，5 ×buffer 10 μL，在 50 μL 體積下，42 ℃水浴 60 min，沸水浴3 min，冰浴3 min，得cDNA。完成逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。COX－2引物序列如下:上游5′－GTC TGA TGA TGT ATG CCA CAA TCT G－3′，下游 5′－GAT GCC AGT GAT AGA GGG TGT TAA A－3′，反應(yīng)產(chǎn)物理論大小為 275 bp;β－actin 引物序列如下:上游5′－CCC AGC ACA ATG AAG ATC AA－3′，下游 5′－TTT CTG CGC AAG TTA GGT TTT GAC AA－3′，反應(yīng)產(chǎn)物理論大小為234 bp。反應(yīng)條件為:95℃，預(yù)變性5 min;94℃，1 min變性;58℃ 50 s退火;72℃ 90 s延伸，循環(huán)40次，72℃最終延伸10 min。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用電泳凝膠成像自動分析儀檢測各擴(kuò)增帶的產(chǎn)物，結(jié)果用下列公式表示:COX－2 灰度值 =COX－2mRNA 密度/β－actin mRNA密度。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析。組間差異進(jìn)行t檢驗處理，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 藥物對細(xì)胞生長的抑制作用

江南卷柏總黃酮干預(yù)后對細(xì)胞生長的抑制呈劑量和時間依賴性，25～100 μg/mL抑制細(xì)胞增殖較明顯，結(jié)果見表1。

表1 江南卷柏總黃酮對HT-29細(xì)胞生長的抑制作用(IC50)

3.2 半定量檢測樣品對 HT－29細(xì)胞 COX－2mRNA表達(dá)的影響

RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，所測灰度值見表2。

圖1 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果圖

表2 各組COX-2mRNA表達(dá)水平(n=6)

4 小結(jié)和討論

本實驗考察了江南卷柏總黃酮處理24 h對結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29 COX－2 mRNA的影響，結(jié)果顯示江南卷柏總黃酮在濃度為20 μg/mL 和40 μg/mL 時能顯著下調(diào) COX－2mRNA 的水平，且呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖1、表2)。實驗還發(fā)現(xiàn)江南卷柏總黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29的生長有一定抑制作用，且呈現(xiàn)劑量和時間的依賴性(表1)，但作用較為溫和，其作用48 h時IC50為 108 μg/mL。

COX－2在各腫瘤組織中都有較高的表達(dá)，本文證明江南卷柏總黃酮能在mRNA水平上抑制COX－2的蛋白質(zhì)表達(dá)，降低PGE2產(chǎn)量，這可能是江南卷柏抗腫瘤作用的機(jī)制之一。本研究為卷柏屬藥用植物黃酮類提取物用于癌證治療提供了一定的理論依據(jù)，將有助于拓展卷柏的藥用價值。

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［2］廣西自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)［M］.南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992，36:169.

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