王 立， 趙 瑛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

葛根芩連湯為張仲景名方，該方由葛根、黃連、黃芩和炙甘草組成，其中甘草具有一定的解毒、抗病毒、抗?jié)兊茸饔?，其主要成分為甘草酸、甘草次酸等?］。中藥提取工藝的差異往往導(dǎo)致其制劑臨床療效差別很大。由于甘草酸胃腸道給藥后在血液中很難檢測(cè)到［2，3］，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定灌服葛根芩連湯全方及單方煎液的家犬體內(nèi)甘草次酸體內(nèi)經(jīng)時(shí)過(guò)程，分析相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，探討煎煮方式對(duì)甘草次酸家犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，以期對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Dinex高效液相色譜儀(P680泵，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-100柱溫箱，UVD-340U二極管陣列檢測(cè)，Chromeleon色譜工作站);XKG6-A型快速混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑

甘草次酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào):A0038)，卡馬西平(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供)，乙腈(色譜純)，其他試劑為分析純。葛根，黃芩，黃連，炙甘草(哈爾濱人和藥店)。

1.3 樣品制備

葛根芩連湯煎劑(T):按處方配比取葛根芩連湯各味藥的飲片(葛根15 g，黃芩9 g，黃連9 g，炙甘草6 g)5份，加水2 000 mL，先煎葛根20 min，余藥共煎30min，煎2次，合并煎液，定容1 000 mL，濃縮至200 mL，備用。

甘草單煎液(S):取炙甘草飲片30 g，加水2 000 mL，投入藥材煎30 min，煎2次，合并煎液定容至1 000 mL濃縮至200 mL，備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康家犬12只，♀♂不限，體重(14±2.3)kg，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:UltimateTM C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.5%冰醋酸水溶液(42:58，V/V);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.2 方法專屬性考察

在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，甘草次酸的保留時(shí)間在6.2 min左右，內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間在3.7 min左右，峰形良好，血清中其他成分干擾測(cè)定，具有較高的特異性，相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 家犬血清中GA的HPLC圖A.空白血清 B.空白血清中甘草次酸和內(nèi)標(biāo) C.家犬灌服甘草單煎液后血清樣品圖 D.家犬灌服T后血清樣品圖 1.卡馬西平2.甘草次酸Fig.1 HPLC Chromatograms of GA in serumA.blank serum B.blank serum spiked with GA and internal standard C.serum sample after administration of decoction S to dogs D.serum sample after administration of decoction T to dogs 1.carbamazepine 2.glycyrrhetinic acid

2.3 血樣采集

12只家犬隨機(jī)分為兩組，每組各6只，給藥前12 h禁食過(guò)夜，于次日早晨空腹分別插管灌胃給予T及S溶液200 mL(相當(dāng)于甘草原藥30 g)。于服藥前和服藥后 1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36 h 分別于股靜脈取血5 mL，置塑料離心試管中離心分離血清置于－25℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血樣處理［4，5］

取1.5 mL血清置具塞玻璃離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)液20 μL渦旋混合2 min;加入5 mL氯仿渦旋混合5 min，3 500 r/min離心10 min，取有機(jī)層4 mL置試管中50℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，15 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取甘草次酸對(duì)照品10.0 mg至10 mL量瓶中，以溶劑H(乙腈:水=8:2，V/V)定容至刻度，得貯備液。貯備液以溶劑H分別稀釋得質(zhì)量濃度為7.5、15、30、60、120 和240 μg/mL 系列工作液，分別取上述工作液10 μL于離心試管中加入家犬血清1.5 mL蝸旋混合2 min后加入內(nèi)標(biāo)液20 μL渦旋混合2 min;得濃度分別為 50、100、200、400、800 和1 600 ng/mL的含藥血清，按“2.4”項(xiàng)下處理、測(cè)定，以峰面積比A對(duì)質(zhì)量濃度C(ng/mL)作加權(quán)線性回歸(W=1/C2)，得方程為:A=0.012 C+0.027，r=0.999 5，血漿中甘草次酸濃度在范圍50～1 600 ng/mL間與峰面積比線性關(guān)系良好，最低定量濃度為50 ng/mL。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

配制低、中、高 3種質(zhì)量濃度(100、400、1 500 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)血樣，相同方法處理后進(jìn)樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甘草次酸日內(nèi)與日間精密度(n=5)Tab.1 Inter-day and intra-day precision of GA in dog serum

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

配制低、中、高 3種質(zhì)量濃度(100、400、1 500 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)血樣，按“2.4”項(xiàng)處理后進(jìn)樣，同時(shí)以相應(yīng)濃度對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，將兩組峰面積進(jìn)行比較計(jì)算絕對(duì)回收率，低、中、高濃度的絕對(duì)回收率分別為(85.3±4.5)%、(84.6±3.9)%和(84.2±3.4)%(n=6)。內(nèi)標(biāo)絕對(duì)回收率為(74.2±3.7)%(n=18)。

2.8 藥-時(shí)曲線

兩組家犬灌服T、S溶液后，甘草次酸平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

2.9 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

家犬灌服葛根芩連湯煎劑和甘草單煎液后，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用非隔室模型處理，Cmax和tmax以實(shí)測(cè)值表示，以末端相若干點(diǎn)血藥濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)時(shí)間進(jìn)行回歸，求得末端消除速率常數(shù)λZ及消除半衰期t1/2;運(yùn)用梯形面積法計(jì)算藥-時(shí)曲線下面積AUC0～t;AUC0～∞=AUC0～t+Ct/λZ。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表 2。

圖2 家犬灌服T、S溶液后甘草次酸的平均藥時(shí)曲線Fig.2 Mean serum concentration-time curve of GA after administration of decoction T and S to dogs

表2 甘草次酸家犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

表2 甘草次酸家犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

參數(shù) 單位 甘草單煎液 葛根芩連湯λZ h－1 13 214±6 327 6 589±1 450 0.097±0.022 0.047±0.014 Cmax ng·mL－1 986.5±116.9 244.8±56.1 tmax h 10.3±1.5 9.7±1.5 t1/2 h 7.4±1.6 15.8±4.3 MRT0-36 h 16.7±1.7 28.3±4.8 MAT0-36 h 2.7±0.9 5.3±0.8 AUC0-36 ng·(h·mL－1)14 483±2 410 4 766±963 AUC0-∞ ng·(h·mL－1)

3 討論

體內(nèi)樣品分析中，樣品的處理是一個(gè)關(guān)鍵步驟，其好壞直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。由于涉及到后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，在參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-6］的基礎(chǔ)上，選擇血清為分析樣品，采用有機(jī)溶劑萃取的方法，處理甘草次酸血清樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所采用的方法可靠，適用于甘草次酸家犬體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

家犬灌胃服用葛根芩連湯和甘草單煎液后，其體內(nèi)甘草次酸藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)有明顯差別，服用T與S相比，甘草次酸的消除半衰期明顯延長(zhǎng);配伍后甘草次酸在家犬體內(nèi)AUC降低，而達(dá)峰時(shí)間沒(méi)有明顯差異;這說(shuō)明配伍后，甘草次酸家犬體內(nèi)入血量降低，清除速率減慢，而方中其他組分的存在并不影響其在體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間。至于出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是方中哪一種成分的單獨(dú)作用還是哪幾種成分的協(xié)同影響以及如何影響，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別詳細(xì)考察。

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［4］田 娟，周彥彬，左 英，等.HPLC-MS-MS測(cè)定血漿中的甘草次酸及生物利用度［J］.中南藥學(xué)，2007，5(5):476.

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