喬 丹 李 麗 李 琴 勞穗華 張賢蘭 吳長有

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 中山大學(xué)“熱帶病防治研究”教育部重點實驗室,廣州 510080）

結(jié)核性胸水中PPD特異性多功能效應(yīng)型記憶T細(xì)胞表型和功能研究①

喬 丹 李 麗 李 琴 勞穗華②張賢蘭②吳長有

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 中山大學(xué)“熱帶病防治研究”教育部重點實驗室,廣州 510080）

目的:探討結(jié)核性胸水中是否存在純化蛋白衍生物（PPD）特異性T細(xì)胞,并對這群PPD特異性T細(xì)胞的表型特征和功能進(jìn)行研究。方法:體外用PPD刺激結(jié)核性胸水細(xì)胞（PFCs）,結(jié)合表面分子和細(xì)胞內(nèi)因子染色方法,分析結(jié)核性胸水細(xì)胞中PPD特異性的T細(xì)胞的表型特征和功能。結(jié)果:在不刺激的條件下,結(jié)核性胸水細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞因子。PPD刺激結(jié)核性胸水細(xì)胞后,主要使CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子。進(jìn)一步分析Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生之間相互關(guān)系,結(jié)果表明PPD特異性CD4+T細(xì)胞大多同時分泌兩種細(xì)胞因子。表型分析表明,結(jié)核性胸水細(xì)胞中分泌Th1細(xì)胞因子的主要是CD45RACD62L-CD27-CCR7-CD4+T細(xì)胞,即效應(yīng)型記憶CD4+T細(xì)胞。結(jié)論:結(jié)核性胸水中存在PPD特異性CD4+T細(xì)胞,這群細(xì)胞是多功能效應(yīng)型記憶CD4+T細(xì)胞,而且可能對結(jié)核菌的控制和清除有重要作用。

PPD;胸水細(xì)胞;Th1細(xì)胞因子;表型;結(jié)核性胸膜炎

純化蛋白衍生物（PPD）是由結(jié)核菌經(jīng)提純、沉 淀、脫水后的結(jié)核蛋白制成。結(jié)核菌素純化蛋白衍生物皮膚實驗,是利用受試者對進(jìn)入人體的結(jié)核菌素引發(fā)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)致皮膚出現(xiàn)硬結(jié)的機(jī)理,而用來診斷結(jié)核菌感染的一種傳統(tǒng)方法,在結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測、選擇預(yù)防治療對象、考核卡介苗接種質(zhì)量、輔助結(jié)核病人的診斷和鑒別診斷等方面應(yīng)用甚廣[1-3]。

結(jié)核性胸膜炎病人約占整個結(jié)核病人群的30%,而且能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答,在不需要抗結(jié)核治療的情況下能夠自愈,因此成為研究結(jié)核病的很好的模型[4]。細(xì)胞免疫應(yīng)答,尤其是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,對機(jī)體抵抗結(jié)核桿菌的感染具有極其重要的意義。結(jié)核性胸水中是否存在PPD特異性T細(xì)胞,這群特異性T細(xì)胞的表型特征和功能如何,目前還不是很清楚。

本文探討了結(jié)核性胸水中PPD特異性CD4+T細(xì)胞的表型和功能特征。結(jié)果表明,結(jié)核性胸水中存在PPD特異性T細(xì)胞,而且主要是多功能效應(yīng)型記憶CD4+T細(xì)胞,可以產(chǎn)生兩種及以上Th1細(xì)胞因子。

1 材料與方法

1.1 對象 廣州市胸科醫(yī)院確診的結(jié)核性胸膜炎病人6例,其中男3例、女3例,年齡24～54歲,平均40歲。其入選標(biāo)準(zhǔn)是:（1）結(jié)合病人病史、胸膜活檢、胸片X線檢查、細(xì)菌學(xué)檢查等確診為結(jié)核性胸膜炎;（2）無慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、糖尿病、高血壓等合并癥;（3）無遺傳病家族史;（4）采集胸水之前,病人沒有用激素等免疫抑制劑治療。

1.2 材料

1.2.1 試劑 PPD由美國AerasGlobal TB Vaccine Foundation惠贈。PerCP抗人 CD4、FITC抗人 CD8、APC 抗人 IFN-γ、FITC 抗人 IFN-γ、PE 抗人 TNF-α、PE-cy7抗 人 TNF-α、APC 抗人 IL-2、FITC 抗 人CD45RA、PE 抗人 CD62L、PE 抗人 CCR7、APC抗人CD27、anti-CD28和anti-CD49d均購自美國BD公司。布雷桿氏菌素A（BFA）、皂苷（Saponin）購自Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)液、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、二巰基乙醇和Hank's液購自美國Gibco公司。葡聚糖泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2.2 儀器 流式細(xì)胞儀（BD FACSA riaⅡ,USA）,CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech,USA）,酶聯(lián)免疫檢測儀ELx-800 Universal Microplate Reader（Bio-TEK instrument.INC）,離心機(jī)Centrifuge 5810（Eppendorf,Germany）。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核性胸水細(xì)胞（PFCs）的分離 利用胸腔穿刺術(shù),抽取結(jié)核性胸膜炎病人的胸水。用Ficoll密度梯度離心法（800克,22℃,20分鐘）,獲得胸水單個核細(xì)胞,充分洗滌后,用RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸（含100m l/L滅活胎牛血清、50 g/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素和50μmol/L二巰基乙醇）,并調(diào)整胸水細(xì)胞（PFCs）濃度為2×106細(xì)胞/m l。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用不同濃度的PPD刺激結(jié)核病人胸水細(xì)胞,放在96孔圓底板中培養(yǎng),每孔200μl,3個復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育3天后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IFN-γ的產(chǎn)生。

1.3.3 ELISA ①用鼠抗人IFN-γ單克隆抗體包被ELISA板,4℃放置過夜,用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗滌后,加入含10%FCS的PBS溶液,室溫封閉1小時;②按照說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品并稀釋樣品,加入ELISA板中,室溫孵育2小時;③洗板后,加入生物素標(biāo)記的鼠抗人IFN-γ單克隆抗體及親合素標(biāo)記的辣根過氧化物酶,室溫孵育1小時;④洗板后,加TMB顯色劑,室溫避光放置30分鐘左右,加10%硫酸終止反應(yīng);⑤用酶標(biāo)儀讀板。IFN-γ ELISA試劑盒檢測靈敏度為4.7 pg/ml。

1.3.4 細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)因子的染色及分析 用PPD刺激胸水細(xì)胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育,在培養(yǎng)過程中加入BFA。收集培養(yǎng)后的PFCs,用PBS洗滌2次。去上清后重懸,分別加入不同熒光素標(biāo)記的抗人CD4、CD8、CD45RA 、CD62L 、CCR7、CD27mAb,4℃避光反應(yīng)25分鐘。孵育結(jié)束后,加PBS洗一次,每管加40克/L多聚甲醛2ml,室溫固定8分鐘。加PBS洗兩次。去上清,加入含有皂苷的破膜緩沖液過夜。分別加入不同熒光素標(biāo)記的抗人IFN-γ、抗人TNF-α或抗人IL-2,4℃避光反應(yīng)30分鐘。孵育結(jié)束后,加PBS洗一遍后重懸。應(yīng)用流式細(xì)胞檢測儀（BD FACSAriaⅡ）檢測細(xì)胞,并用Flow Jo軟件分析流式檢測結(jié)果。在進(jìn)行流式分析時,首先設(shè)門于淋巴細(xì)胞,然后設(shè)門于CD4+和CD8+T細(xì)胞;觀察這些細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子的表達(dá)及其表型特征。

2 結(jié)果

2.1 PPD以劑量依賴方式誘導(dǎo)PFCs產(chǎn)生IFN-γ為了確定PPD的最適刺激濃度,我們加入不同濃度的PPD,在anti-CD28和anti-CD49d存在條件下,刺激結(jié)核性PFCs,用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的IFN-γ。結(jié)果表明（圖 1）,不刺激條件下,結(jié)核性PFCs幾乎不產(chǎn)生IFN-γ。與不刺激條件相比,PPD刺激可以顯著增加PFCs產(chǎn)生IFN-γ,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。并且隨著PPD刺激濃度的增加,IFN-γ產(chǎn)生量也逐漸增加。

2.2 PPD刺激PFCs中CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α 為了確定結(jié)核性胸水中PPD特異性細(xì)胞因子的來源,我們檢測了PFCs中CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α。如圖所示,在不刺激的條件下,無論是CD4+還是CD8+T細(xì)胞都幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞因子（圖2A）。而PPD刺激主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α（圖2B）。統(tǒng)計分析表明,PPD主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子,與CD8+T細(xì)胞相比,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01（圖2C）。

圖1 PPD以劑量依賴方式誘導(dǎo)PFCs產(chǎn)生IFN-γ（n=3）Fig.1 A dose-dependent production of IFN-γby PFCs induced by PPD（n=3）

圖2 PPD主要刺激 PFCs中 CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-αFig.2 Production of IFN-γand TNF-αby CD4+T cells in PFCs induced by PPD

2.3 PPD誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子之間的關(guān)系 PPD可誘導(dǎo)PFCs中CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α（圖 3A）。進(jìn)一步研究三種細(xì)胞因子產(chǎn)生之間的關(guān)系,由圖3B可以看出,對于任意兩種細(xì)胞因子的表達(dá),都存在兩個單陽性和一個雙陽性共三個細(xì)胞亞群,但三個亞群的比例有差異。對于IFN-γ和IL-2來說,IFN-γ+細(xì)胞占4.16%,IFN-γ+IL-2+細(xì)胞占4.2%,IL-2+細(xì)胞占1.02%。對于IFN-γ和TNF-α來說,IFN-γ+細(xì)胞占0.5%,IFN-γ+TNF-α+細(xì)胞占7.86%,TNF-α+細(xì)胞占3.48%。對于IL-2和TNF-α來說,IL-2+細(xì)胞占 0.29%,IL-2+TNF-α+細(xì)胞占5.32%,TNF-α+細(xì)胞占6.02%。統(tǒng)計分析表明,對于 IFN-γ和 IL-2,以 IFN-γ+或 IFN-γ+IL-2+細(xì)胞為主,分別占整個陽性細(xì)胞的44%和45%;對于IFN-γ和TNF-α,以 IFN-γ+TNF-α+為主,占整個陽性細(xì)胞的63%;對于IL-2和 TNF-α,則以 TNF-α+或 IL-2+TNF-α+為主,分別占整個陽性細(xì)胞的 53%和43%（圖 3C）。

圖3 PPD誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子之間的關(guān)系Fig.3 Correlation of Th1 cytokinesproduced by CD4+T cells induced by PPD

圖4 PPD特異性Th1細(xì)胞的表型特征Fig.4 Phenotypic characterization of PPD specific Th1 cells

2.4 結(jié)核性胸水中PPD特異性Th1細(xì)胞的表型特征

為了進(jìn)一步了解PPD特異性的Th1細(xì)胞的表型特征,我們同時檢測了PPD特異性Th1細(xì)胞的表面分子和細(xì)胞內(nèi)因子。結(jié)果表明,產(chǎn)生IFN-γ、IL-2或TNF-α的細(xì)胞主要是效應(yīng)型記憶CD4+T細(xì)胞,這群細(xì)胞的表型特征為CD45RA-CD62L-CD27-CCR7-細(xì)胞。統(tǒng)計分析表明,PPD特異性產(chǎn)生IFN-γ、IL-2或TNF-α的Th1細(xì)胞亞群分布相似。PPD特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞中,CD45RA-CD62L-細(xì)胞亞群占97.6%,CD45RA-CCR7-細(xì)胞亞群占82.95%,CD45RA-CD27-細(xì)胞亞群占83.8%（圖4A）。PPD特異性IL-2+CD4+T細(xì)胞中,CD45RA-CD62L-細(xì)胞亞群占93.85%,CD45RA-CCR7-細(xì)胞亞群占72.1%,CD45RA-CD27-細(xì)胞亞群占 85.7%（圖4B）。PPD特異性TNF-α+CD4+T細(xì)胞中,CD45RACD62L-細(xì)胞亞群占96.2%,CD45RA-CCR7-細(xì)胞亞群占76.15%,CD45RA-CD27-細(xì)胞亞群占84.25%（圖4C）。

3 討論

在結(jié)核性PFCs中,T淋巴細(xì)胞是由多種表型和功能不同的細(xì)胞亞群組成。根據(jù)功能和MHC分子的限制性不同,T細(xì)胞可分為CD4+和CD8+T細(xì)胞;根據(jù)CD45RA的表達(dá)與否,將T細(xì)胞分為初始T細(xì)胞（CD45RA+）和記憶T細(xì)胞（CD45RA-）兩大亞群;初始T細(xì)胞高表達(dá)CD27和CD62L,而記憶T細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)CD62L。此外,根據(jù)CCR7表達(dá)與否,又可將記憶T細(xì)胞分為效應(yīng)型（TEM）和中央型（TCM）兩大亞群[5-7]。CD45RA、CD27和CD62L表達(dá)與否是鑒別初始和記憶T細(xì)胞最常使用的表面標(biāo)志。當(dāng)首先分析CD45RA的表達(dá),然后分析CD27和CD62L表達(dá)時,三者在初始CD4+和CD8+T細(xì)胞的符合率分別為98.8%和95.2%[8]。

本文利用多色流式細(xì)胞檢測技術(shù),以及目前國內(nèi)外常用鑒別初始和記憶T細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體,在單個細(xì)胞水平上對結(jié)核性PFCs中PPD特異性T細(xì)胞亞群進(jìn)行了分析。同時還分析了PPD特異性Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子之間的關(guān)系及其表型特征。

在抵抗結(jié)核菌感染的過程中,細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。CD4+和CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要組成部分,IFN-γ是對結(jié)核菌產(chǎn)生有效細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IFN-γ主要由激活的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞產(chǎn)生,是單核巨噬細(xì)胞的強激活劑,能夠激活巨噬細(xì)胞,增強其有效清除結(jié)核菌的能力[9-11]。TNF-α協(xié)同IFN-γ激活被結(jié)核菌感染的巨噬細(xì)胞,募集巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞遷移至感染部位,封閉感染的病灶并形成肉芽腫,限制結(jié)核菌的進(jìn)一步播散,從而產(chǎn)生抗結(jié)核的免疫保護(hù)作用[12,13]。IL-2的功能主要是促進(jìn)T細(xì)胞增殖,是T細(xì)胞的生長因子,還可使CD8+T細(xì)胞活化為CTL,并且可誘導(dǎo)IFN-γ等多種細(xì)胞因子的分泌,從而產(chǎn)生殺滅結(jié)核的作用[14]。

本研究表明,結(jié)核性PFCs在不刺激條件下,幾乎不產(chǎn)生任何細(xì)胞因子;PPD刺激可以顯著增加Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PPD主要刺激PFCs中CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α。結(jié)核性PFCs中,PPD特異性的細(xì)胞主要是效應(yīng)型記憶CD4+T細(xì)胞,表型特征為CD45RA-CD62L-CD27-CCR7-T細(xì)胞。利用表面分子和趨化因子受體將這些Th1細(xì)胞因子陽性細(xì)胞分群,發(fā)現(xiàn)分泌這三種Th1細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群表型相似,都是以CD45RA-CD62L-,CD45RACD27-,CD45RA-CCR7-為主,尤其是 IL-2和TNF-α的亞群分布基本一致,這可能是由于產(chǎn)生IL-2的細(xì)胞幾乎同時都產(chǎn)生TNF-α。

目前用于確診結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)仍是細(xì)菌學(xué)檢查,但是胸水培養(yǎng)的陽性率很低,不利于結(jié)核的早期診斷,也很難區(qū)分結(jié)核性胸水和其它原因引起的胸腔積液;PPD主要集中在皮試方面的應(yīng)用[15]。本研究通過分析PPD刺激后,結(jié)核性PFCs產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子的類型及表型特征,使我們對PPD在結(jié)核中的作用有了更進(jìn)一步的了解,也為PPD更廣泛應(yīng)用于臨床診斷提供了依據(jù)。

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[收稿2010-05-10 修回2010-06-02]

（編輯 張曉舟）

A study on the phenotypic characterization and function of PPD specificmuli-functional effector memory T cells in pleural fluids

QIAODan,LILi,LIQin,LAOSui-Hua,ZHANGXian-Lan,WUChang-You.DepartmentofImmunology,Zhongshan SchoolofMedicine,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl（SunYat-SenUniversity）,MinistryofEducation,Guangzhou510080,China

Objective:To explorewhether PPD specific T cells exist in pleural fluids from patientswith tuberculosis pleurisy and analyze the phenotypic characterization and function of these cells.Methods:Pleural fluid cellswere incubated with PPD in vitro.Cell surface staining and intracellular stainingwere used to analyze the production of cytokines by PPD specific T cells and the phenotypic characterization.Results:Pleural fluid cells didn't p roduce any cytokine inmedium alone.Following the stimulation with PPD in vitro,CD4+T cells in pleural fluidswere themain source of PPD specific Th1 cytokines.Further we investigated the correlations among the Th1 cytokine production,and found that these PPD specific CD4+T cellsmainly coexpressed two Th1 cytokines（IFN-γ,IL-2 or TNF-α）.Phenotypic analysis indicated that these cytokine-producing pleural fluid cellweremainly polyfunctionaleffectormemory CD4+T cellswith the phenotypeof CD45RA-CD62LCD27-CCR7-.Conclusion:Our data indicats that PPD specific CD4+T cells exist in pleural fluids from patientswith tuberculosis pleurisy.These cells are polyfunctional effectormemory CD4+T cells,which could produce two ormore Th1 cytokines.Theymay play an important role in the control ofmycobacterium tuberculosis infections.

PPD;PFCs;Th1 cytokines;Phenotype;Tuberculosis,pleurisy

R392

A

1000-484X（2010）12-1114-05

①本文為十一五基金（2008ZX10003011）和國家自然科學(xué)基金資助項目（30872300）

②廣州市胸科醫(yī)院,廣州510095

喬 丹（1984年-）,女,在讀博士,主要從事免疫記憶方面的研究,E-mail:qiaodan840924@163.com;

及指導(dǎo)教師:吳長有（1955年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事疫苗和免疫記憶方面的研究,E-mail:Changyou-wu@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.013