王光蘭 陳 爽 王心蕊 石英愛 張麗紅 劉曉會 吳 珊

（吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室,長春 130021）

白細胞介素1β誘導腎小管上皮細胞轉分化及其對細胞骨架的影響①

王光蘭 陳 爽 王心蕊②石英愛 張麗紅 劉曉會 吳 珊

（吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室,長春 130021）

目的:觀察白細胞介素1β（IL-1β）誘導腎小管上皮細胞轉分化及其對細胞骨架的調節(jié)作用。方法:選擇永生化的大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E,經體外培養(yǎng)后以 IL-1β（30μg/L）分別誘導3天及 6天,觀察細胞形態(tài);RT-PCR半定量檢測細胞α-平滑肌動蛋白（α-SMA）和細胞骨架成分β-actin、α-tubulin的mRNA表達;免疫熒光染色觀察α-SMA蛋白表達及骨架蛋白β-actin、α-tubulin在細胞內的分布及排列。結果:培養(yǎng)的NRK52E細胞經IL-1β體外誘導3天及6天后,細胞中α-SMAmRNA及蛋白表達水平與相應的對照組細胞比較明顯增多（P＜0.001）,提示NRK52E上皮細胞出現了表型轉化,此時培養(yǎng)細胞的形態(tài)也發(fā)生了改變,由典型的多邊鋪路石樣變?yōu)槌衫w維細胞樣,并有多個突起,細胞骨架蛋白β-actinmRNA的表達也稍有增多（P＜0.05）;其蛋白的分布排列也發(fā)生了改變,由胞膜轉移至核周及胞漿,形成束狀纖維樣結構。但IL-1β誘導組細胞的另一個骨架蛋白α-tubulinmRNA表達和分布與對照組比較無明顯不同。結論:IL-1β能夠誘導體外培養(yǎng)的NRK52E細胞轉分化,此過程中細胞形態(tài)變?yōu)槌衫w維細胞樣,多突起;骨架蛋白β-actin也表達增加,并出現了骨架重建;而α-tubu lin在此過程中則沒有明顯變化。

白介素 1β ;轉分化 ;α-SMA;β-actin;α-tubulin

越來越多的研究顯示腎小管上皮細胞發(fā)生表型 轉化（EMT）是參與腎纖維化的重要因素之一[1],無論是在免疫性的還是非免疫性的腎臟疾病模型中,腎間質巨噬細胞的積聚與腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展具有明顯相關性[2,3]。白介素1β（IL-1β）作為巨噬細胞產生的一種炎性介質,很可能在腎小管間質纖維化過程中發(fā)揮作用,有報道IL-1β可以誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,成為肌成纖維細胞[4]。為進一步明確IL-1β的促腎小管上皮細胞轉分化作用,本研究以大鼠永生化腎小管上皮細胞株NRK52E為實驗對象,觀察IL-1β促進NRK52E細胞轉分化作用,同時觀察在其轉分化過程中是否伴有細胞骨架的改變,為IL-1β促腎小管上皮細胞轉分化可能的機制研究提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)細胞 永生化大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E購于中科院上海細胞庫,培養(yǎng)在含10%優(yōu)級胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液中。

1.2 主要試劑 優(yōu)級胎牛血清（Hyclone）;H-DMEM培養(yǎng)基（Gibco）;α-SMA,β-actin,α-tubulin 多克隆抗體（北京博奧森）;FITC-IgG,CY3-IgG（北京中衫）;RNA抽提試劑,逆轉錄試劑,PCR試劑盒（TaKaRa）;重組白細胞介素1β（Perprotech INC）。

1.3 引物 采用Primer primier 5.0設計并由上海生工合成,具體序列見表1。

1.4 細胞培養(yǎng) NRK52E細胞培養(yǎng)于37℃、5%、CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基為H-DMEM+10%胎牛血清（FBS）,取對數生長期細胞,0.05%胰酶消化后以適當濃度重新接種,待細胞貼壁后進行分組:對照組3%FBS+H-DMEM+PBS;誘導組3%FBS+H-DMEM+IL-1（30μg/L）,分別作用3天和6天,各組細胞數及培養(yǎng)液體積均相等,隔天換液。

1.5 培養(yǎng)細胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)細胞在倒置顯微鏡下觀察,比較不同時間實驗組和對照組細胞的形態(tài)并照相記錄。

1.6 RT-PCR檢測α-SMA 和細胞骨架蛋白β-actin、αtubulinmRNA的表達 根據Tri Reagent說明書提取細胞總 RNA,測A 260/A280在1.8～2.0之間,說明RNA純度較高,根據OD260值計算RNA濃度。按逆轉錄試劑說明書逆轉錄合成第一條cDNA鏈,以等量cDNA為模板進行PCR反應。以GAPDH為內參,GAPDH、α平滑肌動蛋白（α-SMA）、β-actin 和 α-tubulin的反應條件均為:94℃變性2分鐘,然后進入循環(huán),94℃30秒,55℃30秒,72℃40秒,最后72℃延伸5分鐘。循環(huán)數分別為:26、36、26、28個循環(huán)。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像后,用GEL-Pro4圖像分析軟件進行灰度掃描,以IOD代表其表達量,用GAPDH的量進行校正,以目的基因與GAPDH比值的相對量進行分析。實驗重復三次。

1.7 培養(yǎng)細胞的免疫熒光染色

1.7.1 細胞爬片制備 預先在24孔板中放置無菌小蓋玻片,取對數生長期細胞,細胞收集和分組同上,分別誘導3天和6天后取蓋玻片經4%多聚甲醛固定10分鐘,-20℃冷甲醇繼續(xù)固定20分鐘,PBS洗3遍,備用。

1.7.2 細胞免疫熒光染色 0.1%TritonX-100打孔,PBS洗5分鐘×3次;血清封閉37℃,30分鐘;分別加入一抗 ,即抗 α-SMA（1∶100）,抗 β-actin（1∶100）及抗α-tubulin（1∶100）抗體,37℃孵育1小時;PBS洗5分鐘×3次,滴加相應的二抗（1∶50）,常溫避光反應30分鐘,PBS洗5分鐘×3次,激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 IL-1β對細胞形態(tài)的影響 對照組細胞培養(yǎng)至第6天始終未發(fā)生形態(tài)改變,呈典型的多邊鋪路石樣,細胞間銜接緊密（見圖1A）。而誘導組細胞于誘導的第2天部分細胞即由原來的多邊鋪路石樣向成纖維細胞樣改變,誘導3～6天后大部分細胞呈成纖維細胞樣,多突起,分散生長,部分細胞肥大變形,大小不一（見圖1B）。

2.2 IL-1β對細胞轉分化標志物α-SMA和細胞骨架蛋白β-actin、α-tubulin mRNA表達的影響 內參GAPDH的mRNA表達條帶各組相同,經IL-1β誘導的細胞在誘導的第3天和第6天其α-SMAmRNA表達均明顯高于相應的對照組細胞。同時誘導組細胞在誘導第3天和第6天,細胞骨架蛋白β-actinmRNA表達與相應的對照組細胞相比也呈輕度增加狀態(tài),但另一骨架蛋白α-tubulinmRNA表達無論是誘導第

表1 引物序列及產物的長度Tab.1 The sequences of the PCR amplication primers

3天還是第6天與其相應的對照組相比均未見明顯改變（見圖2,表2）。誘導組細胞α-SMA mRNA和βactinmRNA表達的增加并未隨誘導時間的延長進一步加強,即誘導組細胞誘導的第6天與誘導第3天相比,細胞α-SMA、β-actin mRNA的表達量未見明顯差異（數據未顯示）。

2.3 IL-1β對α-SMA蛋白表達及對細胞骨架成分βactin、α-tubulin分布排列的影響

2.3.1 α-SMA 培養(yǎng)至第3、6天的對照組細胞 α-SMA表達極其微弱,其陽性部位主要位于細胞核周圍,經IL-1β作用3天和6天的誘導組細胞,其細胞內α-SMA表達明顯增強,不僅在核周有較強的熒光團存在,在胞漿及細胞的突起中,也可見較強的α-SMA陽性的熒光物質分布（見圖3A、B）。

圖1 相差顯微鏡下所見誘導6天的細胞形態(tài)（×100）Fig.1 The cellmorphology after stimulated by IL-1βfor 6 days on phase contrastm icroscope（×100）

圖2 IL-1β 對 NRK52E細胞 α-SMA 和骨架 蛋白 β-actin、αtubulin的mRNA表達的影響Fig.2 The effect of IL-1β on expression ofα-SMA and skeleton protein β-actin,α-tubulin mRNA in NRK52E cells

2.3.2 β-actin 在培養(yǎng)的第3天和第6天,對照組細胞β-actin陽性染色主要積聚在細胞膜下,形成板層樣結構,細胞漿內幾乎無β-actin陽性染色。經IL-1β分別作用3天和6天后 ,誘導組β-actin的陽性染色發(fā)生明顯改變,表現為在細胞漿中出現較多βactin陽性的束狀纖維樣結構,連接細胞膜與細胞核,部分沿細胞長軸縱行排列,細胞突起中也見絲狀排列的β-actin陽性染色,細胞膜下的板層樣結構變薄甚至消失,在核膜周圍出現強陽性的β-actin熒光團（見圖 3C、D）。

2.3.3 α-tubu lin IL-1β分別作用3天和 6天的誘導組細胞α-tubulin陽性染色與對照組細胞無明顯差異,均表現為細胞內α-tubulin陽性染色在核的一側分布較為密集,α-tubulin陽性的粗絲狀纖維以此為中心向周圍細胞漿放射并交叉成網狀,相互纏繞,似鳥巢（見圖3E、F）。

3 討論

腎小管間質纖維化和慢性炎細胞浸潤是許多慢性腎臟疾病發(fā)展到晚期的共同表現,近幾年有研究表明在腎小管間質纖維化的過程中,炎細胞產生的多種生物活性介質均有誘導腎間質內成纖維細胞和腎小管上皮細胞轉分化形成肌成纖維細胞的能力,而肌成纖維細胞又是慢性腎間質纖維化產生細胞外基質（ECM）的主要來源細胞[5]。本實驗我們選擇由巨噬細胞產生的炎癥介質IL-1β,在相關文獻[4,6]的基礎上進行了濃度篩選,確定30μg/L作為本實驗的作用濃度,作用于體外培養(yǎng)的NRK52E細胞,首先檢測IL-1β體外誘導NRK52E細胞向間充質細胞轉分化的能力,結果顯示,NRK52E細胞經IL-1β誘導3天后其細胞內肌成纖維細胞的特異標志α-SMA在基因及蛋白水平上的表達均明顯增加,表明IL-1β能夠在體外誘導NRK52E腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉化。與此同時我們還觀察到培養(yǎng)的NRK52E細胞在發(fā)生表型轉化的同時,細胞形態(tài)也發(fā)生了明顯改變,由典型的多邊鋪路石狀變成多突起的成纖維細胞樣。

表2 IL-1β誘導 3天后 NRK52E細胞 α-SMA、β-actin 和 αtubulin mRNA的相對表達量Tab.2 IL-1β induced relativemRNA exp ression ofα-SMA,βactin andα-tubulin in NRK52E cells after 3 days

圖3 IL-1β誘導6天后對NRK52E細胞內α-SMA蛋白表達,β-actin和α-tubulin分布排列的影響Fig.3 The expression ofα-SMA protein and the distributions and arrangements of β-actin and α-tubulin changes in NRK 52E cells after stimulated by IL-1βfor 6 days

眾所周知,細胞形狀的維持與細胞骨架的結構和排列密切相關,微絲和微管是細胞骨架的主要組成成分,它們與細胞形態(tài)的維持,細胞器的空間定位及位置的改變,細胞的運動,細胞內的物質運輸和信號轉導等活動密切相關[7]。因此本實驗分別以微絲成分β-actin和微管成分α-tubulin作為觀察靶點,觀察了IL-1β在誘導NRK52E細胞發(fā)生轉分化的過程中對細胞骨架的調節(jié)作用,RT-PCR結果顯示IL-1β在促進NRK52E細胞發(fā)生轉分化的同時其β-actin mRNA的表達也輕度增加。為進一步研究IL-1β在促進NRK52E細胞轉分化的過程中對細胞骨架分布排列的影響,我們對β-actin和α-tubulin骨架蛋白進行了免疫熒光染色,發(fā)現IL-1β使β-actin骨架蛋白的分布排列發(fā)生了明顯變化,其在細胞膜下形成的板層樣結構變薄甚至消失,在胞核周圍積聚形成強陽性的β-actin熒光團,在細胞漿中形成較多的束狀纖維樣結構,連接細胞膜與細胞核,部分沿細胞長軸縱行排列并伸入細胞突起中,說明在 IL-1β誘導NRK52E細胞發(fā)生轉分化的過程中,微絲成分β-actin不僅在mRNA水平表達增多,還在分布及排列上發(fā)生了骨架重建,至于這些變化僅僅是 IL-1β誘導NRK52E細胞發(fā)生轉分化過程中的一種現象,還是βactin的骨架重建在轉分化過程中參與了信號傳導及蛋白調節(jié)作用尚需進一步研究。作為細胞骨架的另一重要組成成分,微管蛋白α-tubulin無論在mRNA水平還是在分布排列上都未發(fā)現有明顯變化,可能是α-tubulin在細胞內的表達及分布相對較為穩(wěn)定,IL-1β尚不能引起其明顯改變。

值得注意的是,目前很多的RT-PCR多是采用βactin、α-tubulin等骨架蛋白作為內參,而本實驗結果表明,IL-1β誘導NRK52E細胞轉分化過程中細胞內的β-actinmRNA的水平也會發(fā)生改變,因此,在涉及該類實驗時,應慎重選擇RT-PCR內參。

1 Kalluri R,Neilson EG.Epithelial-mesenchymal transition and its implication for fibrosis[J].JClin Invest,2003;112（12）:1776-1784.

2 Saito T,Atkins RC.Contribution ofmononuclear leukocytes to the progression of experimental focal glomerular sclerosis[J].Kidney Int,1990;37（4）:1076-1083.

3 Lan H Y,Paterson D J,Atkins RCetal.Initiation and evolution of interstitial leukocytic infiltration in experimental glomerulomephritis[J].Kidney Int,1991;40（3）:425-433.

4 陳廷芳,陳 明,秦建華etal.白細胞介素1β誘導腎小管上皮細胞的轉分化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007;11（23）:4470-4472.

5 唐 嶸,樊均明.肌成纖維細胞與腎間質纖維化[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志,2002;3（5）:308-310.

6 李 超,吳瑜瑜.白細胞介素1β對人眼小梁細胞基質金屬蛋白酶-3表達的影響[J].臨床眼科雜志,2008;16（4）:298-301.

7 劉繼紅,蔡學泳,何其華.細胞骨架的激光共聚焦研究技術[J].中國醫(yī)學裝備,2005;2（6）:49-51.

[收稿2009-11-20 修回2010-01-11]

（編輯 張曉舟）

Interleukin-1βinduced transdifferentiation of renal tubular epithelial cells and its effect on the cytoskeleton

WANGGuang-Lan,CHENShuang,WANGXin-Rui,SHIYing-Ai,ZHANGLi-Hong,LIUXiao-Hui,WUShan.KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To investigate the effectof interleukin-1β （IL-1β）on epithelial-mesenchymal transition（EMT）and cytoskeleton rearrangementof renal tubular epithelial cells.Methods:Immortalized renal tubular epithelial cell line NRK52Ewas cu ltured in vitrowith IL-1β（30 μg/L）for 3 days and 6 days,then the cellmorphology was observed;ThemRNA exp ressions of α-smooth muscle actin（α-SMA）,cytoskeleton componentsβ-actin and α-tubulinwere semi-quantitative exam ined by RT-PCR.The proteinexpression ofα-SMA and arrangementsof β-actin and α-tubulin were assessed by immunofluorescent staining.Results:After induced by IL-1β for 3 days and 6 days in vitro,themRNA and protein expressionofα-SMA increased significantly comparedwith corresponding control cells（P＜0.001）,it prompted that NRK52E cells underwent EMT;At the same time,the cellmorphology also changed,from a typicalmultilateral paving stone to fibroblast-like appearance,with mu ltiple processes;Cytoskeletal proteinβ-actinmRNA exp ression was also slightly increased（P＜0.05）.The distributions and arrangements ofβ-actin protein were also changed,from cellmembrane transferred to peri-nucleus and cytoplasm,moreover it formed fiberbundle-like structures.However,another cytoskeleton protein α-tubu lin in IL-1β induced cells,neither it'smRNA expression nor it's distribution had significant differences comparedwith the controlgroup.Conclusion:IL-1βcan induce NRK52E cellsundergoing EMT in vitro,cellmorphology changesinto fibroblast-like appearancewithmultiple processes,and also the cytoskeleton proteinβ-actin expression increases and rearrangementoccurrs.However,there was no changes onα-tubu lin.

Interleukin-1β ;Transdifferentiation;α-SMA;β-actin;α-tubulin

R329.2

A

1000-484X（2010）03-0210-04

①本文為教育部高校優(yōu)秀青年教師獎勵計劃（201182）和吉林省衛(wèi)生廳重點實驗室基金

②吉林大學人獸共患病研究所,長春130061

王光蘭（1981年-）,女,在讀醫(yī)學博士,主要從事腎臟病理學研究;

及指導教師:吳 珊（1962年-）,女,教授,博士生導師,主要從事腎臟病理研究。