韋三華 董 軻 林 芳 王 希 李 斌 沈建軍 張利軍 劉昕陽 張惠中

（西安第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗、輸血科,西安 710038）

HCV HLA-A2限制性復合多表位基因的構建、克隆表達及其免疫特性分析①

韋三華 董 軻 林 芳 王 希 李 斌 沈建軍 張利軍 劉昕陽 張惠中②

（西安第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗、輸血科,西安 710038）

目的:構建丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性復合多表位基因的原核表達載體,表達純化,并觀察其免疫原性。方法:分別合成HCV HLA-A2限制性多表位基因、人泛素基因,串聯(lián)后得到融合基因Ub-Mep,克隆入原核表達質粒pRSETA,轉化E.coliBL21,IPTG誘導融合蛋白表達,薄層掃描分析表達蛋白組成;可溶性分析后用Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化、透析并濃縮融合蛋白;Western blot分析純化蛋白的特異性和抗原性;免疫小鼠分析其免疫原性。結果:成功構建復合多表位抗原基因的原核表達質粒pRSET-Ub-Mep,目的基因可高效表達,表達產物主要以包涵體形式存在,Ni2+-NTA純化可獲得目的蛋白,純化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。結論:成功構建HCVHLA-A2限制性復合多表位基因并進行原核表達,表達的多表位基因抗原具良好的免疫原性,為進一步的HCV A2限制性復合多表位誘導的細胞免疫應答研究奠定基礎。

丙型肝炎病毒（HCV）;CTL;表位;表達

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達載體pRSET-A、菌種DH5α、BL21均由本室保存;Trizol試劑購于Gibco BRL公司;脂質體購于Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、內切酶購于TaKaRa公司;逆轉錄試劑盒購于Promega公司;Ni2+-NTA凝膠親和層析柱購自Qiagen公司;RPM IMedium 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸熒光素標記的羊抗人IgG抗體、HRP標記羊人IgG、DNA分子標準和低分子蛋白質標準分別購自華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 HCV HLA-A2限制性復合多表位基因的構建

1.2.1.1 人泛素基因合成 根據人泛素基因序列（GeneBank:M 17524）。合成泛素基因,同時在上游引入BamHⅠ酶切位點,并在ATG前加一個kozak序列,下游引入PstⅠ酶切位點,并將第76位氨基酸進行替換（G acc變A tgc）,全序列252 bp,交由北京奧科公司合成,克隆入pMD19-TSimple載體,記作Ub。

1.2.1.2 多表位基因的合成 選擇4個CTL優(yōu)勢表位和一個CD4+Th表位（表1）,每個表位兩端各保留三個氨基酸,各表位間用AAY分隔連接,后端增加信號肽基序,以便于各表位保持獨立性和能夠有效呈遞。5′和3′端分別引入PstⅠ和 HindⅢ酶切位點。全序列285 bp,交由北京奧科公司合成,得到多表位基因成表位序列,克隆入pMD19-TSimple載體,計作記作Mep。

1.2.1.3 多表位基因表達載體的構建 原核表達載體為pRSET-A,先將泛素基因Ub用BamHⅠ/PstⅠ雙酶切后插入到pRSET-A載體中的相應位點,構建pRSET-Ub重組原核表達載體;再將多表位基因Mep用PstⅠ/HindⅢ雙酶切后插入到pRSET-A載體中的相應位點,構建成pRSET-Ub-Mep重組原核表達載體,不改變其編碼區(qū)的框架結構。重組質粒的鑒定采用雙位點單酶切鑒定,酶切鑒定得到的陽性克隆,送TaKaRa公司進行核苷酸序列測定,用生物軟件pcgene分析匯總結果。

表1 表位基因位置及氨基酸組成Tab.1 Source,position,and sequence of epitopeam ino acid

1.2.2 HCV HLA-A2限制性復合多表位基因原核表達

1.2.2.1 目的蛋白表達和可溶性分析 重組質粒,轉化大腸桿菌BL21,挑取單菌落（同時設空載體質粒轉化的大腸桿菌BL21為對照）,置5ml LB培養(yǎng)液中（含氨芐青霉素50 g/L）,37℃振搖過夜,次日1∶100轉接5m l LB培養(yǎng)液中37℃振搖3小時,A600約0.4～0.6時加入IPTG至終濃度1mmol/L,繼續(xù)振搖4～5小時,離心收菌。用PBS（pH8.0）懸浮離心收集的細菌,加入溶菌酶至終濃度0.1 r/min/L,4℃放置20分鐘,超聲破碎,4℃下10 000 r/min離心10分鐘,收集上清和沉淀,分別加入等體積的2×樣品緩沖液,沸水中加熱5分鐘,12 000 r/min離心5分鐘,取上清,每孔15μl進行SDS-PAGE電泳,電泳在恒壓下進行（濃縮膠中為160 V,分離膠中為120 V）。電泳結束后,將凝膠浸泡于考馬斯亮藍染色液中染色2小時,然后用脫色液脫色至背景清晰。薄層掃描分析目的蛋白表達帶占菌體蛋白百分比。

1.2.2.2 表達蛋白的純化 參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱（Ni2+-NTA）操作說明進行。首先離心收集1 L誘導宿主菌,冰浴15分鐘;按5 L/kg濕菌的比例加入含8 mol/L尿素 的Buffer B（pH8.0）,室溫下輕輕攪拌使細菌裂解至溶液清亮,4℃下10 000 r/min離心收集上清,棄去沉淀;將1m lNi2+-NTA樹脂懸浮液與一定量清亮裂解上清于室溫輕柔搖動混勻（100 r/min搖動15～60分鐘）后,將其混合液裝柱 ;依次用 Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗脫,分別收集洗脫液。取各部分樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.2.3 Western blot檢測表達蛋白 將純化蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,然后將蛋白質進行電轉移至NC膜上（濾膜孔徑0.22μm,轉移條件為恒流100V,1小時）。用丙型肝炎陽性患者混合血清（來自唐都醫(yī)院檢驗科）作為一抗,HRP-羊抗人IgG作為二抗,DAB（0.6 g/L）顯色,至目的條帶染色清晰時終止反應。

1.2.3 HCV HLA-A2限制性復合多表位抗原免疫原性分析 表達蛋白用適量的PBS溶解,腹部皮下多點注射免疫6周齡BALB/c小鼠,劑量為100μg/（只·次）。隔兩周加強免疫一次,共免疫3次。對照組小鼠每次用 PBS 免疫。免疫后第 0、2、4、6、8、10周尾靜脈采集小鼠血清,-20℃凍存。用包被緩沖液將表達蛋白稀釋到0.01μg/μl,每孔100μl包被微孔板,濕盒中4℃過夜。PBST（PBS,0.1%Tween20）洗滌后用封閉液（PBST,50 g/L脫脂奶粉）室溫封閉1小時。PBST洗滌后拍干,每孔加入封閉液1∶100稀釋的小鼠血清100μl,濕盒中37℃孵育1小時,PBST洗滌、拍干,加入以封閉液 1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG 100μl,濕盒中37℃孵育1小時。PBST洗滌、拍干,每孔加入顯色液（OPD 5mg pH 7.5檸檬酸鹽緩沖液12.5ml,H2O 25μl）100μl,37℃孵育 10～20分鐘,每孔加1滴2 mol/L硫酸終止反應。酶標儀測定OD490。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定 pRSET-Ub-Mep經BamHⅠ+HindⅢ雙酶切得到537 bp的預期片段（圖1）。酶切鑒定的陽性克隆,經測序,與設計序列完全一致。表明目的基因成功克隆入真核表達載體。

2.2 目的蛋白的表達與溶解形式分析 將重組質粒pRSET-Ub-Mep轉化的BL21菌株用1 mmol/L IPTG誘導4小時后,收集菌體,溶菌酶作用后進行超聲破碎,離心后分別收集沉淀和上清,經SDSPAGE電泳檢測,在約20 kD處有一明顯的條帶,與預期的融合蛋白大小一致。該融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中,上清液中幾乎無誘導表達的融合蛋白。薄層掃描顯示其占菌體蛋白的25%（圖2）。

2.3 融合蛋白的表達及純化 用8mol/L尿素裂解菌體,然后將裂解上清通過Ni2+-NTA柱,收集各部分洗脫液。取少量B表達蛋白包涵體、8mol/L尿素裂解上清、Buffer B（pH8.0）、Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗脫液進行 SDSPAGE,電泳結果顯示目的蛋白在Buffer E（pH 4.5）洗脫液中,掃描顯示純度在90%以上（圖3）。

圖1 重組質粒pRSET-Ub-M ep的酶切鑒定Fig.1 Restrictive enzyme digestion analysis of pRSET-Ub-Mep

2.4 表達蛋白的Western blot結果 純化后的蛋白透析、包埋濃縮后取少量該蛋白和未誘導菌體蛋白行SDS-PAGE,然后電轉移至NC膜上。用HCV陽性患者血清作為一抗,同時以正常人血清為對照,HRP-羊抗人IgG為二抗,DAB顯色后,預期大小處可見條帶染色清晰,純化的蛋白很好地保持了與HCV陽性患者血清的結合活性（圖4）。

2.5 表達蛋白免疫原性分析 融合蛋白免疫BALB/c小鼠 3次后,ELISA分析小鼠抗體產生情況,結果顯示（圖5）,3次免疫后,表達蛋白可在小鼠中誘發(fā)較高水平的抗體應答,其血清中的特異性抗體滴度平均為1∶640。說明表達蛋白具有良好的免疫原性。而生理鹽水陰性對照組的小鼠血清抗體為陰性。

圖2 表達蛋白SDS-PAGE和溶解形式分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

圖3 N i2+-NTA凝膠純化表達蛋白洗脫圖Fig.3 Purification of the expressed protein in Ni2+-NTA column

圖4 表達蛋白的W estern blot分析Fig.4 Western b lot of expressed protein

圖5 免疫小鼠誘導的免疫應答Fig.5 Antibody response in m ice immunized w ith expressed protein

3 討論

丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病的主要致病因子之一,其感染后極易慢性化,而發(fā)展為肝硬化和肝癌的幾率遠高于乙型肝炎病毒。HCV感染已成為嚴重危害公眾健康的感染性疾病之一。目前對于HCV感染的治療,主要為peg-IFN-α聯(lián)合利巴韋林,但其臨床有效率尚不足50%,而且副作用很大,花費昂貴。亟需發(fā)展有效的預防性和治療性疫苗以防止其傳播。

HCV感染后,機體針對病毒產生了由中和抗體、CD4+輔助 T細胞和CD8+細胞毒性 T細胞（CTL）介導的適應性免疫反應。由于使用缺乏校對功能的RNA依賴的RNA多聚酶及HCV感染后快速復制可產生HCV各種準類群（準種）,使HCV能夠逃逸宿主的免疫應答;另外,由于存在中和抗原位點的E區(qū)基因高度變異（HRV1和HRV2）,也使機體產生的中和抗體缺乏保護力,不能有效地清除病毒。這些可能都是造成HCV持續(xù)感染的原因。研究發(fā)現,HCV感染的患者若能在感染的早期產生較強的針對HCV各個蛋白的多表位特異性CTL,則患者的感染多表現為自限性[1],且病毒的清除與應答的強度、廣度和維持時間有關[3];而當患者特異性CTL的活性較低或僅針對個別表位時,則可導致HCV感染的持續(xù)狀態(tài),并可造成肝組織的慢性損傷。黑猩猩感染實驗也表明,CD8+T細胞在病毒清除和阻止慢性化過程中發(fā)揮關鍵作用,但同時CD4+輔助T細胞在CD8+T細胞清除病毒過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用,缺乏CD4+輔助T細胞的作用,CD8+T細胞清除病毒的水平將大大下降,而且HCV感染復發(fā)的保護免疫依賴于CD4+和CD8+記憶性T細胞[4]。Form等[5]發(fā)現NS3特異性CD4+T細胞免疫反應對于病毒的清除似乎是必需的。近年來利用陽離子脂質體為載體的HCV NS3上CD4+輔助性T細胞表位疫苗,也誘導出顯著的Th1型細胞免疫應答[6]。細胞介導的免疫反應,尤其是CD8+T細胞應答,在防御HCV慢性感染中有重要的作用。因此建立強大的多位點特異性細胞免疫是克服HCV免疫逃逸及發(fā)展HCV實驗疫苗的首選策略。

多表位疫苗的顯著特點是能有效應付病原微生物的變異和免疫反應中的一些不利因素,在誘生細胞免疫方面具有獨特的優(yōu)勢,可發(fā)展成為多價疫苗。因此,多表位疫苗已成為疫苗的研究熱點之一,并已在HIV、HBV、HPV和黑色素瘤等多種高變異的病原體及腫瘤疫苗中進行了實驗性的探索,取得了令人滿意的結果[7-9]。通過在表位間增加間隔、進行氨基酸替換和引入內質網定位信號肽基序,以及表位與泛素相連,把疫苗編碼的蛋白導入泛素-蛋白酶體途徑等,使各表位能夠被有效呈遞,誘導表位特異性的細胞免疫應答[7,10-13]。

我們將四個HCV保守的CTL表位和一個CD4+表位串聯(lián),前端添加人泛素序列,后端添加內質網信號肽序列。人泛素引物設計時引入在ATG前增加一個kozak序列,提高轉錄和翻譯效率。并把泛素分子的最后一個氨基酸（76位）用A來替代原來的G,這樣蛋白水解酶就不能把泛素分子從融合蛋白中水解下來,這種穩(wěn)定的體系很容易被多聚泛素化,從而增強蛋白的降解率。利用我們以前多表位連接方法,在表位間增加丙-丙-酪氨酸（AAY）間隔和側翼修飾,提高表位抗原能在體內被呈遞的效率[14]。我們成功構建了丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性復合多表位基因的原核表達載體pRSET-Ub-Mep,轉化E.coliBL21,IPTG誘導融合蛋白表達,目的基因可高效表達,純化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。為丙肝多表位疫苗的研究提供了靶抗原,為進一步的HCV A 2限制性復合多表位誘導的細胞免疫應答研究奠定基礎。

1 Houshton M,Abrignani S.Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus[J].Nature,2005;436:961-966.

2 韋三華,尹 文,雷迎峰etal.丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的構建及其免疫原性[J].中國生物制品學雜志,2007;20（9）:633-636.

3 KawaiT,AkiraS.Innate immune recognitionofviral infection[J].Nat Immunol,2006;7:131-137.

4 FolgoriA,Capone S,Ruggeri Letal.A T-cell HCV vaccine eliciting effective immunity againstheterologous virus challenge in chimpanzees[J].NatMed,2006;12（2）:190-197.

5 Form X,Bukh J,Purcell RH.The challenge of developing a vaccine against hepatitis C virus[J].JHepatol,2002;37:684-695.

6 Gao M,Wang H P,Wang Y Netal.HCV-NS3 Th1minigene vaccine based on invariant chain CLIP genetic substitution enhances CD4+Th1 cell responses in vivo[J].Vaccine,2006;24（26）:5491-5497.

7 Isbilka G Y,Fikes J,Hermanson Getal.Utilization of MHC classⅠtransgenicm ice for developmentofm inigene DNA vaccinesencodingmultiple HLA-restricted CTL epitopes[J].J Immunol,1999;162（7）:3915-3925.

8 Doan T,Herd K,Ramshaw Ietal.A polytope DNA vaccine elicitsmultiple effectorandmemory CTL responsesand protectsagainsthuman papillomavirus16 E7-expressing tumor[J].Cancer Immunol Immunother,2005;54（2）:157-171.

9 John A,Huseyin F,Anne Petal.Enhancedmultiepitope-based vaccines elicit CD8+cytotoxic T cellsagainstboth immunodom inant and cryptic epitopes[J].Vaccine,2005;23:1085-1091.

10 Brian D,Livingston,Mark Newmanetal.Optimizationofepitopeprocessing enhances immunogenicity ofmultiepitope DNA vaccines[J].Vaccine,2001;19（32）:4652-4660.

11 VeldersM P,SanneWeijzen,Eiben G Letal.Defined flanking spacers and enhanced proteolysis isessential for eradication of established tumors by an epitope string DNA Vaccine1[J].J Immunology,2001;166（9）:5366-5373.

12 FiratH,TourdotS,Ureta-Vidal Aetal.Design ofa polyepitopeconstruct for the induction of HLA-A0201-restricted HIV 1-specific CTL responses using HLA-A*0201 transgenic H-2 classⅠKOmice[J].J Immunol,2001;31（10）:3064-3074.

13 Pinchuk I,Starcher BC,Livingston Betal.A CD8+T cell heptaepitope m inigene vaccine induces protective immunity againstChlamydia pneumoniae[J].J Immunol,2005;1;174（9）:5729-5739.

14 韋三華,尹 文,雷迎峰etal.丙型肝炎病毒多表位基因真核載體的構建及在真核細胞中的表達[J].中國生物制品學雜志,2006;19（1）:24-27.

[收稿2009-09-21]

（編輯 張曉舟）

Genetic construction of HLA-A2 restricted multi-epitopes gene of hepatitis C virus,expression and purification in E.coli for antigenic analysis

WEISan-Hua,DONGKe,LINFang,WANGXi,LIBin,SHENJian-Jun,ZHANGLi-Jun,LIUXin-Yang,ZHANGHui-Zhong.DepartmentofClinicalLaboratoryandBloodTransfusion,TangduHospitalFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710038,China

Objective:To construct the recombinant prokaryotic p lasmid to express HCVHLA-A2 restrictedmulti-CTL epitopes and to purify the fused protein for antigenic analysis.Methods:The human ubiquitin gene andmu lti-CTL epitopes genewas synthesized respectively,and digested by restrictenzymebefore being cloned into pRSET-A.Then it was transformed intoE.coliDH5αand the positive recombinant plasmid named pRSET-Ub-Mepwas sequenced.Target protein was distinctly expressed after transformed intoE.coliBL21 and induced with IPTG.Thus the proteinwas scanned and purified on Ni2+-NTA column aswellasWestern b lot performed after solubility analysis.Results:The recombinant plasmid pRSET-Ub-Mep was successfu lly constructed and it could efficiently exp ress the targetgene.Protein productionwasmain ly in inclusion body and could be purified through Ni2+-NTA column.The purified protein kept theantigen activity.Conclusion:Thegene encoding for HCVHLA-A2-restrictedmulti-CTL epitopes is efficiently exp ressed and the target protein is purified,which establishes a foundation of further research to evaluate the cellular immune response induced by the targetgene.

Hepatitis C virus（HCV）;Cytolytic T lymphocyte;Epitope;Gene expression

韋三華（1972年-）,男,博士,副教授,主要從事分子病毒學方面的研究。對HCV各個蛋白的多表位特異性CTL,則患者的感染多表現為自限性（Nature 2005）[1],提示CTL活性對HCV感染的控制具有重要作用。越來越多研究也表明,特異性的CTL反應在清除HCV和阻止病毒傳播中起著關鍵的作用。因此,HCV的CTL免疫優(yōu)勢表位有利于預防和治療性疫苗的研制開發(fā)。我們在前期HCV多表位基因免疫特性研究的基礎上[2],選擇優(yōu)勢的CTL表位進行串聯(lián),通過間隔和側翼修飾,前后端分別加上泛素（Ubiquitin）和內質網定位信號肽基序,以提高各個獨立表位被抗原呈遞細胞的遞呈效率。我們把合成表位,信號肽基序和泛素序列克隆入原核表達載體,觀察其表達情況和免疫原性。為進一步分析多表位基因誘導細胞免疫應答研究奠定基礎。

R373.21

A

1000-484X（2010）03-0201-05

丙型肝炎病毒（HCV）感染后55%～85%轉為慢性病毒性肝炎,并可導致肝纖維化及肝細胞癌（HCC）。目前對HCV感染的治療除了重組α干擾素（IFN-α）有一定療效外,仍無有效的抗病毒治療方法。尤其是包膜糖蛋白E2的中和性抗原位點存在高變區(qū)（HVR）,從而使以體液免疫為主的預防HCV感染的疫苗研究長期以來進展甚微。研究發(fā)現,HCV感染的患者若能在感染的早期產生較強的針

①本文為國家自然科學基金項目（No.C0700760）

②通訊作者