楊玲娟 焦成瑾 葛 勐 雍寶霞

(天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水 741001)

旋復(fù)花為菊科旋復(fù)花屬的一種多年生草本植物，其性苦、辛、咸、微溫，具有降肺胃之氣、消痰止咳、清熱解毒、止血等作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，旋復(fù)花中含有旋復(fù)花素、旋復(fù)花內(nèi)酯，同時(shí)含有槲皮素、異槲皮素、咖啡酸、綠原酸、菊糖及蒲公英甾醇等多種甾醇類物質(zhì)。研究表明，槲皮素具有抗癌、防癌、抗血小板凝聚、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗過敏等多種生物活性，且對(duì)人體無毒[2]；同時(shí)槲皮素具有潛在的抗抑郁作用和增強(qiáng)記憶的功能[3]，因此槲皮素具有很高的藥用價(jià)值。隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，含有槲皮素的旋復(fù)花在中醫(yī)方面的應(yīng)用也會(huì)越來越廣泛，具有很高的藥用價(jià)值。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已有人測定旋復(fù)花中旋復(fù)花內(nèi)酯的含量[4]，但對(duì)于旋復(fù)花中槲皮素含量的測定仍未見報(bào)道。筆者采用高效液相色譜法對(duì)旋復(fù)花藥材中槲皮素含量進(jìn)行測定研究，為綜合利用與開發(fā)旋復(fù)花的藥用價(jià)值及質(zhì)量監(jiān)控提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Aglient 1100 LC型，配VWD紫外檢測器，美國安捷倫公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

槲皮素對(duì)照品：中國藥品生物制品鑒定所；

旋復(fù)花：市售；

磷酸(0.2%)、鹽酸(2.3%)：分析純；

甲醇：色譜純；

實(shí)驗(yàn)用水為重蒸去離子水。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸，體積比為65∶35，流速為1.0 mL/min；檢測波長：370 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成0.5 mg/mL的槲皮素儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取3.00 mL該溶液置于50 mL容量瓶中，定容至刻度配制成30 μg/mL的對(duì)照品溶液。取20 μL進(jìn)樣，槲皮素對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 槲皮素對(duì)照品色譜圖

1.4 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取經(jīng)60℃干燥2 h后研磨并過80 μm(180目)標(biāo)準(zhǔn)篩的旋復(fù)花樣品0.500 0 g，置于50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇20.00 mL、鹽酸20.00 mL，于溫度70℃、功率500 W、頻率40 kHz條件下超聲萃取60 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣，樣品色譜圖見圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定波長的選擇

將槲皮素對(duì)照品溶液在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，光譜顯示在370 nm處有最大吸收峰，故測定波長選擇370 nm。

2.2 流動(dòng)相的選擇

考察了不同比例的甲醇-磷酸(0.2%)流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，當(dāng)甲醇與磷酸(0.2%)的體積比為65∶35、流速為1.0 mL/min時(shí)，樣品中槲皮素分離良好，且峰形對(duì)稱。

圖2 樣品色譜圖

2.3 柱溫的選擇

柱溫對(duì)樣品保留時(shí)間影響很大，同時(shí)對(duì)于分離效果也有影響。柱溫過低，保留時(shí)間過長；柱溫過高，對(duì)色譜柱影響很大，出峰過于密集，不能達(dá)到良好的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫選擇40℃時(shí)，樣品中槲皮素的峰形較好，且與其它共存組分的分離效果好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確移取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00 mL置于7個(gè)50 mL容量瓶中，然后加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，配制成系列槲皮素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，移取20 μL溶液在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以槲皮素色譜峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=64.152X+79.332，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為5.0～100.0 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取槲皮素對(duì)照品溶液20 μL，在相同色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積分別為1 996、1 935、1 968、1 950、1 948、1 986，經(jīng)計(jì)算峰面積平均值為1 964，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。由此可見，方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g旋復(fù)花樣品5份，按樣品制備方法制成樣品溶液，各取20 μL進(jìn)樣，5次進(jìn)樣的峰面積分別為809、808、803、804、798，平均值為804，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%(n=5)，由此可見該方法重復(fù)性良好。

2.7 回收試驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法，在已知含量的旋復(fù)花樣品溶液中加入適量的槲皮素對(duì)照品溶液進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表1。由表1可見，方法的平均回收率為97.1%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測定

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g旋復(fù)花樣品1份，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算得槲皮素含量為3.42 mg/g。

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法測定了旋復(fù)花中槲皮素的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確、快速，為綜合利用與開發(fā)旋復(fù)花提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可作為旋復(fù)花質(zhì)量控制的有效手段。

[1] 錢名坤,陳澤乃,秦國偉,等.線葉旋復(fù)花化學(xué)成分的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),1983,41(3):254-255.

[2] 趙維中,戴俐明,方明,等.槲皮素在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1992.8(6)：452-455.

[3] 陳箐筠,干信.槐米中槲皮素的提取及其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程,2007(3):11-13.

[4] 許俊博,吳怡,徐贊美,等.用RP-HPLC測定旋復(fù)花中旋復(fù)花內(nèi)酯的含量[M].中國藥學(xué)雜志,2003,38(1): 57-59.