王英婷,黃燮南,王淑蘭

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室,貴州 遵義 563003;2.焦作市五官醫(yī)院,河南 焦作 454150）

紫杉醇聯(lián)合染料木黃酮對人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721的作用

王英婷1,2,黃燮南1,王淑蘭2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室,貴州 遵義 563003;2.焦作市五官醫(yī)院,河南 焦作 454150）

目的利用中效原理體外定量分析紫杉醇及染料木黃酮聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的作用。方法采用MTT法觀察兩種藥物單用及合用對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的抑制率,然后用中效方程計(jì)算各自的中效濃度,并計(jì)算兩種藥物合用時(shí)的合用指數(shù)(CI）。結(jié)果兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)隨著藥物劑量的增加,其效應(yīng)也增加,紫杉醇的中效濃度為 8.912μmol/L,染料木黃酮的中效濃度為 163.680μmol/L。兩種藥物合用時(shí)的中效濃度為 58.340μmol/L。大劑量合用(大于中效濃度）時(shí) CI＜1,表示協(xié)同;小劑量合用(小于中效濃度）時(shí)CI＞1,表示拮抗。結(jié)論紫杉醇聯(lián)合染料木黃酮對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721有抑制作用,兩種藥物大劑量合用時(shí)具有協(xié)同作用,小劑量合用時(shí)則相互拮抗。

肝癌細(xì)胞;紫杉醇;染料木黃酮;中效原理

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721由本院微生物教研室提供,然后由本實(shí)驗(yàn)室傳代。主要藥品和試劑:染料木黃酮(Sigma公司）,紫杉醇注射液(上海華聯(lián)制藥有限公司）,RPMI-1640培養(yǎng)基(美國 Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物濃度設(shè)計(jì) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721用含體積分?jǐn)?shù) 10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%青霉素、鏈霉素）培養(yǎng),置于 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育備用。先將紫杉醇注射液稀釋成 1 g/L的母液,臨用前將該母液用生理鹽水稀釋成實(shí)驗(yàn)濃度 1.315、2.630、5.260、13.170、26.340μmol/L。染料木黃酮用 DMSO配成1 mol/L的母液,于 -20℃保存,臨用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋,使 DMSO＜0.01%,實(shí)驗(yàn)濃度為 11.25、22.50、45.00、90.00、180.00 μmol/L。

1.2.2 MTT法檢測藥物效應(yīng)[4]取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞,用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞的濃度為 5×104個(gè)/L的細(xì)胞懸液,在 96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入 200μL進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)試劑對照組、腫瘤細(xì)胞陰性對照組及各種藥物組。將兩種單藥的 5個(gè)不同濃度分別加在96孔板內(nèi),每孔加藥量 20μL,每個(gè)劑量 3個(gè)平行孔,重復(fù) 3次。兩種藥物合用比例為 1∶1,每孔加藥總量20μL(每種單藥濃縮 1倍各加 10μL）。在 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h后,用自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國 Bio-Rad-550型,波長 492 nm）測定每孔的 OD值。

1.3 結(jié)果判定 fa=1-(實(shí)驗(yàn)組平均 OD值/對照組平均 OD值）×100%,用自動(dòng)酶標(biāo)儀測得的 OD492值進(jìn)行計(jì)算,然后按中效方程 fa/fu=(D/Dm）m計(jì)算中效濃度,其中 fa為抑制率,非作用部分 fu=1-fa,D為藥物濃度,m為斜率,Dm為中效濃度(即產(chǎn)生 0.5效應(yīng)時(shí)的藥物濃度）。對中效方程 fa/fu=(D/Dm）m兩邊取對數(shù),logfa/fu=mlogD-mlogDm。設(shè) Y=logfa/fu,X=logD,a=-mlogDm,b=m;代入中效方程 Y=bX-a。根據(jù)該公式計(jì)算出兩種藥物單用及合用時(shí)各自的中效濃度 Dm(logDm=-a/m）;再計(jì)算出單用及兩種藥物合用在各種效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)(combination index,CI）,CI=D1/DX1+D2/DX2+α(D1D2/DX1DX2）,其中可由 fa/fu=(D/Dm）m求得 D=Dm(fa/fu）1/m,D1、D2為兩種藥物合用產(chǎn)生 X效應(yīng)時(shí)兩者各自所需濃度,DX1、DX2為兩種藥物單用產(chǎn)生 X效應(yīng)時(shí)各自的濃度,分別可由 DX=Dm1(X/1-X）1/m1,DX2=Dm2(X/1-X）1/m2求出。α=0為兩種作用機(jī)制不同的藥物,α=1為作用機(jī)制相同的藥物。CI＜1表示協(xié)同,CI=1表示相加,CI＞1表示拮抗。由于紫杉醇及染料木黃酮為作用機(jī)制不同的藥物,故 α=0。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇及染料木黃酮單用及合用時(shí)的指數(shù) 兩種藥物單用及合用時(shí),隨著藥物濃度的增加,其效應(yīng)也增加。根據(jù)上述公式,計(jì)算兩種藥物單用及合用時(shí)的抑制率 fa,以及不同抑制率 fa時(shí)斜率 m、中效濃度 Dm和相關(guān)系數(shù) r。以抑制率 fa為橫坐標(biāo),CI為縱坐標(biāo)作量效曲線,進(jìn)而判斷兩藥在不同效應(yīng)時(shí)各自所需藥物濃度之間相互作用是否為協(xié)同、相加還是拮抗。詳見表 1～3,圖 1。

2.2 染料木黃酮及紫杉醇合用時(shí)的中效濃度 紫杉醇及染料木黃酮合用時(shí)的中效濃度為58.340μmol/L,當(dāng)合用效應(yīng)在 0.500時(shí),CI為 1.00,說明兩種藥物在該效應(yīng)時(shí)的實(shí)際濃度分別為 52.210、6.120μmol/L。當(dāng)合用效應(yīng) fa分別為 0.900、0.800、0.700、0.600、0.550、0.500、0.400、0.300、0.200、0.100時(shí),對應(yīng)的CI分別為 0.443、0.586、0.718、0.852、0.927、1.000、1.197、1.450、1.845、2.730。詳見表 2。

表 1 染料木黃酮及紫杉醇不同濃度單用及合用時(shí)的抑制率fa(n=9）

表 2 染料木黃酮及紫杉醇單用及合用時(shí)的各種指數(shù)

圖 1 染料木黃酮及紫杉醇合用時(shí)的量效曲線

3 討論

紫杉醇是國際上公認(rèn)的抗瘤效果好、抗瘤譜廣的一線抗腫瘤藥物[5],因其能使微管蛋白和組成微管蛋白的二聚體失去平衡,促進(jìn)微管蛋白聚合、微管裝配、防止解聚,從而阻止腫瘤細(xì)胞的生長。盡管臨床上針對不同腫瘤已形成一系列聯(lián)合化療方案,但仍存在較嚴(yán)重的骨髓抑制、神經(jīng)毒性和肌肉毒性[6-7]。因此,尋找能與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用降低其劑量的藥物具有重大意義。

染料木黃酮為異黃酮類化合物,屬于活性較弱的植物雌激素,廣泛存在于豆科植物中。近年來國內(nèi)外大量研究證實(shí),染料木黃酮具有廣泛的抗腫瘤活性,可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤血管的生成,加強(qiáng)多種細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用,被認(rèn)為是頗具前景的抗腫瘤藥和抗腫瘤輔助藥[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染料木黃酮與紫杉醇在體外單用時(shí),對 SMMC-7721肝癌細(xì)胞均有抑制作用,且有量效關(guān)系,其相關(guān)系數(shù) r分別為 0.973、0.998。這表明染料木黃酮與紫杉醇對肝癌細(xì)胞在體外都有抗增殖作用。

從染料木黃酮及紫杉醇合用時(shí)的效應(yīng)和 CI的關(guān)系圖可以看出,兩種藥物在高效應(yīng)時(shí)(大于中效劑量）為協(xié)同作用(CI＜1）,在低效應(yīng)時(shí)(小于中效劑量）為拮抗作用(CI＞1）,在效應(yīng)為 0.5時(shí),CI=1,說明兩種藥物在該效應(yīng)劑量時(shí)相互作用為增加。而且兩種藥物在合用時(shí)的中效濃度均低于單用時(shí)的中效濃度。

聯(lián)合用藥是腫瘤化療的基本原則之一,聯(lián)合用藥可以選擇高效應(yīng)時(shí)最小劑量進(jìn)行,進(jìn)而減少藥物的毒副反應(yīng)。染料木黃酮及紫杉醇在體外合用時(shí)可以協(xié)同抑制人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721的增殖,降低單用時(shí)的劑量,從而降低藥物的毒副反應(yīng)。本研究為兩種藥物聯(lián)合用于肝癌的治療提供了重要線索。

[1] 賈林,李瑜元.染料木黃酮(genistein）對腫瘤的防治作用及其機(jī)制[J].廣州醫(yī)藥,2000,31(1）:12-13.

[2] Satoh H,Ishikawa H,Fujimoto M,et al.Angiocytotoxic therapy in human non-small cell lung cancer cell lines--advantage of combined effects of TNP-470 and SN-38[J].Acta Oncol,1998,37(1）:85-90.

[3] Chou TC,Talalay P.Quantitativeanalysisof dose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors[J].Adv Enzyme Regul,1984,22:27-55.

[4] 湯為學(xué),駱云鵬,王瑞雪.人實(shí)體瘤抗癌藥物敏感試驗(yàn) MTT法的建立[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,17(2）:103-108.

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[6] 劉本葉,葉和春,李國鳳.抗癌新藥紫杉醇的研究概況[J].植物學(xué)通報(bào),1995,12(3）:8-14,27.

[7] 王海燕,李運(yùn)曼,劉國卿.紫杉醇抗癌機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,1999,23(4）:209-214.

[8] 孔令泉.染料木黃酮抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊,1999,26(5）:285-288.

The Effects of Paclitaxel Combined with Genistein on the Hepatoma-Cellular Strain SMMC-7721

Wang Yingting1,2,Huang Xienan1,Wang Shulan2
(1.Department of Pharmacology,ZunyiMedical College,Zunyi 563003,China;2.Jiaozuo Five Sense Organs Hospital,Jiaozuo 454150,China）

Objective To analyze the effects of paclitaxel and genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 by using median-effect principle,quantitively in vitro.MethodsThe inhibitions of paclitaxel,genistein or paclitaxel combined with genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 weremeasured by MTT assay,and the correspondingmedian effective concentrationswere calculated with medianeffect equation;when the various concentrations of the two drugs used,the combination indexes(CI）were calculated.ResultsThe effects of the individual drugs were increased with a concentration dependentmanner.The median effective concentration of paclitaxel was 8.912 μmol/L and thatof genistein was 163.680μmol/L.However,when the two drugs used in combination,themedian effective concentration was 58.340μmol/L.The CIwas＜1 at thehigher concentration(more thanmedian effective concentration）combination(synergism）,and the CIwas＞1 at the lower concentration(less than median effective concentration）combination(indicating antagonism）.ConclusionThe effects of paclitaxel combined with genistein on hepatoma-cellular strain SMMC-7721 are inhibition,synergistic at the high concentration combination and antagonistic at the lower concentration combination.

hepatoma cell;paclitaxel;genistein;median-effect princip le染料木黃酮是異黃酮類化合物,屬于活性較弱的植物雌激素。近年來大量的流行病學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)染料木黃酮對腫瘤具有預(yù)防、治療和抑制轉(zhuǎn)移作用[1]。另外,染料木黃酮對環(huán)磷酰胺、表阿霉素、5-Fu等細(xì)胞毒藥物具有增效作用[2]。紫杉醇為抗瘤譜較廣的一線抗腫瘤藥,但染料木黃酮與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用還未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)在體外觀察兩者單用及合用時(shí)對人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721生長的作用,并根據(jù)中效原理[3]定量分析兩種藥物的相互作用。

R 735.7;R 73-36

A

1673-5412(2010）05-0372-03

王英婷(1971-）,女,碩士,主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。E-mail:tingwang19@yahoo.com.cn

黃燮南(1943-）,男,教授,主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。E-mail:huangxienan@yahoo.com.cn

2010-09-06）