胡 平，宋速快，林開春

(1.恩施職業(yè)技術學院 生物工程系，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學與技術學院，湖北 武漢 430070；3.湖北省農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢查中心，湖北 武漢 430070)

交沙霉素是由那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它的抗菌譜與紅霉素相似，對G+菌及某些G-菌包括淋球菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、支原體等有效.日本抗生物質醫(yī)藥品基準及衛(wèi)生部標準中收載的含量測定方法為微生物檢定法.近幾年，國內(nèi)出現(xiàn)利用分光光度法測定交沙霉素含量的報道[1～3].也有采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法[4～7]、液相色譜-質譜聯(lián)用技術(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)及液相色譜-電噴霧離子質譜聯(lián)用技術(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，LC-ESI-MS)檢測藥片中或血糖中交沙霉素含量的報道[8]，方法準確、靈敏、簡便，但未曾有對發(fā)酵液中交沙霉素含量測定的研究.本文經(jīng)試驗建立了RP-HPLC測定發(fā)酵液中交沙霉素含量的方法，該方法色譜系統(tǒng)簡單，能將交沙霉素與發(fā)酵液中的雜質組分實現(xiàn)很好分離.

圖1 流動相pH與保留值的關系

表1方法的精密度測定結果(n=6)

Tab.1 The result of the accuracy of analytical measure(n=6)

編號測定值/μg·mL-1平均值/μg·mL-1RSD/%1392.72391.03392.2391.30.454388.35390.86393.1

1 材料與色譜條件

1.1 材料

1.1.1 供試菌株：交沙霉素產(chǎn)生菌那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)，由武漢天惠生物工程有限公司研究所保藏并提供.

1.1.2 實驗儀器：美國Waters高效液相色譜儀.

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 交沙霉素對照品由武漢天惠生物工程有限公司提供.斜面培養(yǎng)基：土豆泥，10%；麥片，2.5%；精氨酸，0.02%；瓊脂 2.0%；消前pH7.2～7.4.種子培養(yǎng)基：葡萄糖，1.0%；淀粉，1.0%；黃豆餅粉，1.5%；硫酸鎂，0.05%；酵母粉，0.5%；碳酸鈣，0.3%；磷酸氫二鉀，0.5%；消前pH8.0.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，2.0%；棉籽餅粉，2.0%；豆油，1.0%；碳酸鈣，0.3%；玉米淀粉，4.0%；磷酸二氫鉀，0.03%；面筋粉，2.0%；硫酸鎂，0.05%；消前pH 8.0.

1.2 色譜條件

色譜柱：C18反向柱4.6 mm×250 mm ；填料：Hypersil ODS2 5 μm；流動相：甲醇-0.02mol/L KH2PO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；檢測波長：232 nm；流速：1 mL/min.

2 方法與結果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的優(yōu)化 按參考文獻[9]以甲醇與0.02 mol/L KH2PO4溶液二元系統(tǒng)作流動相，探索其中甲醇比例分別為60%，70%，80%，90%時對各成分保留時間及分離程度的影響.試驗發(fā)現(xiàn)隨著流動相中甲醇比例的增加，峰形逐漸改善，峰的保留時間也逐漸變短，但綜合較短的保留時間和與其他的雜質峰分離度，以甲醇比例為80%為最佳.在甲醇-0.02 mol/L KH2PO4溶液(80∶20)條件下，以1 mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值，以選擇分離效果較佳保留時間t適中的緩沖液pH值，結果見圖1.由圖1可以看出，流動相緩沖液的pH越小，保留時間相應變小，考慮到緩沖液pH對色譜柱的損害，緩沖液的pH設置為3.

2.1.2 緩沖液濃度對色譜行為的影響 KH2PO4溶液濃度設置0.005，0.01，0.015，0.02 mol/L四個濃度，根據(jù)分離效果選擇合適的KH2PO4溶液濃度.緩沖液濃度對色譜行為影響相對較小，濃度變小時，保留時間也相應變長，濃度過大又對影響色譜柱的使用壽命，所以綜合考慮緩沖液濃度0.02 mol/L，用1 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.

2.2 標準工作曲線、線性范圍

準確稱取交沙霉素標樣0.01 g，用適量甲醇溶解，超聲波處理，置于容量瓶中用甲醇定容至10 mL，并用流動相將其配置成31.25，62.5，125，250，400，500，800 μg/mL的標樣，在設定的色譜條件下進行定量分析，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標作標準曲線，得到分析方法的回歸方程為y=49267x+804795,相關系數(shù)r=0.996 6,結果表明，交沙霉素濃度在31.25～800 μg/mL之間用HPLC檢測具有很好的線性關系.

2.3 精密度試驗

同一樣品在相同色譜條件下進行6次平行測定，結果見表1.試驗測得其峰面積的RSD為0.45%，說明方法的精密度良好.

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品，按上述方法配成樣品溶液進行含量測定.將樣品溶液分別在室溫下放置0，4，8，16，24，48 h后進樣測定，其峰面積的RSD為0.64%，表明該樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

表2 交沙霉素加樣回收試驗結果(n=6)

圖2 交沙霉素對照品的HPLC檢測圖譜

圖3 供試發(fā)酵液的HPLC檢測圖譜

2.5 回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品適量，加入標準品適量，用流動相溶解并制成每1 mL中約含1 mg的溶液，依上述方法測定，用標準曲線計算含量，并計算回收率，結果見表2.測得回收率在97.88%～100.07%之間，平均回收率在99.18%，RSD為0.79%，說明方法的準確度良好.

2.6 樣品的測定

將供試菌株在斜面培養(yǎng)基上活化，于28℃培養(yǎng)7～10 d，得到新鮮的斜面孢子.將斜面孢子接入種子培養(yǎng)基，于28℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)30 h.以10%接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)8 d后放瓶.移取交沙霉素發(fā)酵液5 mL加入4倍體積的甲醇，浸提24 h即得到具有生物活性的交沙霉素浸提液.在設定的色譜條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，計算各針峰面積的重復性，待相鄰兩針的峰面積變化<1.0%時，按照標樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進樣測定.標樣和供試發(fā)酵液的圖譜見圖2、3.

3 討論

在優(yōu)化HPLC法檢測交沙霉素的色譜條件時，通過調(diào)整流動相的比例、流動相的pH、緩沖液濃度大小的變化，確定了適宜的色譜條件[色譜柱為C18反向柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫為室溫；流動相為磷酸緩沖液(0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用1 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)-甲醇(體積比為20∶80，pH3)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長為232 nm；進樣量為10 μL]，能很好地改善峰形，保留時間可控制在6～7 min.有研究報道[10]使用乙腈和緩沖液作為流動相，但是考慮到乙腈的毒性，本試驗中暫未使用.

在研究中，交沙霉素濃度在31.25～800 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與濃度呈良好的線性關系(r=0.996 6)，測得樣品的相對標準偏差為0.45% ，方法回收率的相對標準偏差為0.49%，本法可用于交沙霉素定量測定.發(fā)酵液中的雜質成分對交沙霉素出峰的干擾較大，但供試發(fā)酵液樣品的色譜圖顯示，本方法能使發(fā)酵液中交沙霉素主成分與其他雜質組分實現(xiàn)良好分離，能準確地測定交沙霉素的含量.

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