趙娜，朱琳，馮鳴鳳

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071

1 引言（Introduction）

我國水生態(tài)基準(zhǔn)的制定研究零星、分散，當(dāng)前我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的標(biāo)準(zhǔn)值主要是參考美國各州、日本、前蘇聯(lián)、歐洲等國家及地區(qū)的水質(zhì)基準(zhǔn)值和標(biāo)準(zhǔn)值來確定，沒有考慮我國水生態(tài)系統(tǒng)的區(qū)域性特征（趙娜等，2010）.水生態(tài)體系的區(qū)域性特征如水文條件、氣候等多種因素都會(huì)影響污染物在水環(huán)境中的物理、化學(xué)和生物過程，因而可能導(dǎo)致不同的生態(tài)效應(yīng)，這就要考慮到水生態(tài)系統(tǒng)的差異性對(duì)水生態(tài)基準(zhǔn)的影響（孟偉等，2006）.因此，在制定水生態(tài)基準(zhǔn)時(shí)，開展環(huán)境因子對(duì)污染物毒性影響的研究是十分必要的.

鉻（Cr）在環(huán)境中廣泛分布，并且廣泛用于涂料、金屬制造、合金和制革等工業(yè)生產(chǎn)中（王大勇等，2007）.鉻的毒性與其存在的狀態(tài)有極大的關(guān)系，自然水體中主要以三價(jià)鉻（Cr3+）和六價(jià)鉻（Cr6+）的形式存在，Cr6+的毒性較強(qiáng)，約為Cr3+的100倍，Cr6+具有強(qiáng)致癌變、致畸變、致突變作用（Vajpayee et al.,2000;徐衍忠等，2002）.有調(diào)查顯示，Cr6+在我國的十大流域片都存在著不同程度的污染（胡必彬，2003）.在水生系統(tǒng)及水生食物鏈中，藻類作為水生動(dòng)物的食物及氧氣來源，占有重要位置.重金屬通過各種途徑進(jìn)入水體后，首當(dāng)其沖的受害者就是藻類生物，藻類相對(duì)細(xì)菌或水生動(dòng)物而言，對(duì)毒物更敏感（邱昌恩，2006;Pascal et al.,2000）.目前已有很多關(guān)于重金屬對(duì)藻類影響的研究（Rai et al.,1981;Rojickova-Padrtova and Marsalek,1999）.小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻是典型的代表藻種，廣泛存在于我國的水體中，對(duì)其的研究已有很多報(bào)道（王莉等，2009;魏群等，2008;楊州等，2005）.

OECD（theOrganizationforEconomicCooperation and Development）提出的淡水藻生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)規(guī)范（OECD,2006）目前已被廣泛應(yīng)用于研究污染物對(duì)藻類的毒性的實(shí)驗(yàn)研究中，它已成為被國際公認(rèn)的進(jìn)行金屬對(duì)藻類毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)規(guī)范之一（Heijerick et al.,2002）.本實(shí)驗(yàn)按照OECD提出的淡水藻生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)規(guī)范，選取72h藻生物量為指標(biāo)，研究了不同環(huán)境因子pH條件下，重金屬Cr6+對(duì)小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻的毒性效應(yīng)，旨在為研究重金屬對(duì)水生生物及水生態(tài)系統(tǒng)的毒害作用以及我國水體質(zhì)量基準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 材料

2.1.1 藻種

小球藻（Chlorella vulgaris,FACHB-6）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus,FACHB-416）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa,FACHB-524）均購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫.

2.1.2 試劑

重鉻酸鉀（K2Cr2O7）以及配制營(yíng)養(yǎng)液所用的藥品（見表1）均購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，均為分析純.

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

人工氣候箱，分光光度計(jì)，生物顯微鏡，凈化工作臺(tái)，血球計(jì)數(shù)板，高壓滅菌鍋，pH計(jì)，照度計(jì).

2.3 藻類培養(yǎng)

采用BG11培養(yǎng)基，由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫提供配方.由于EDTA會(huì)與重金屬形成螯合物，影響重金屬的毒性（Ma et al., 2003;Calace and Petronio,2004;Zhou and Zhang, 1997），所以培養(yǎng)液中去掉EDTA，培養(yǎng)液的組成見表1，pH=8.0.

表1 BG11培養(yǎng)基Table 1 BG11 nutrition solution

將100mL培養(yǎng)液裝入到250mL三角瓶中，用滅菌鍋120℃高壓滅菌20min，接種時(shí)在超凈工作臺(tái)上紫外滅菌20min.接入適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻，放入光照培養(yǎng)箱，溫度（25±2）℃，光照4000~ 6000Lux，光暗比為 12h:12h.每天人工搖瓶 3~4次，隨機(jī)更換瓶的位置，使其受光均勻.

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

EC50被認(rèn)為是最精確的毒性效應(yīng)值，但是它僅僅能反映不同毒物的毒性大小或者不同受體對(duì)毒物的耐受性大小，而不能用作安全暴露濃度. OECD曾推薦用NOEC和EC05、EC10或EC20置信區(qū)間的下限來作為安全暴露基準(zhǔn)濃度（Isnard et al., 2001）.NOEC（No Observed Effect Concentrations）是指毒性作用與對(duì)照組無顯著差異的最大處理濃度.有研究指出，在以NOEC為毒性效應(yīng)值時(shí)，應(yīng)該同時(shí)給出最小觀察效應(yīng)值（Van der Hoeven et al.,1998）， 即 LOEC（LowestObserved Effect Concentrations）（與對(duì)照組有顯著差異的最小濃度）.

采用國際通用的“瓶法”，嚴(yán)格按照OECD-201淡水藻生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)指南（OECD,2006），以72h藻生物量為測(cè)試終點(diǎn)，計(jì)算比生長(zhǎng)率和抑制率，采用SPSS 13.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用多重比較Dunnett-t檢驗(yàn)確定Cr6+對(duì)小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻產(chǎn)生效應(yīng)的NOEC和LOEC（VanderHoeven,1997;周永欣等，1993;王長(zhǎng)友等，2007;莊德輝和周晏敏，1994）并對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出EC10和EC20.

其中，μ表示比生長(zhǎng)率，d-1；Xj表示第j天的初始藻細(xì)胞數(shù)，mL-1，Xi表示第i天的藻細(xì)胞數(shù)，mL-1；ti某時(shí)段初始時(shí)間，d；tj表示某時(shí)段結(jié)束時(shí)間，d.

其中，I為抑制率；μc為對(duì)照組的比生長(zhǎng)率，μt為處理組的比生長(zhǎng)率.

2.5 預(yù)備試驗(yàn)

2.5.1 繪制OD-N標(biāo)準(zhǔn)曲線

表征藻生物量的方法有很多，本文以光密度（OD）值來代表藻細(xì)胞密度（N）.由于在紫外波段干擾比較多，所以在600~740nm波段對(duì)小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻進(jìn)行全波段掃描，3種藻在690nm附近有最大吸收峰.

取一定量的藻在顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并測(cè)定其吸光值，建立藻細(xì)胞密度（N）與光密度值（OD690）間的線性關(guān)系（pH=8.0），見圖1.回歸方程：小球藻，y=2923.775x-8.480，R2=0.996；斜生柵藻，y=2749.501x+13.246，R2=0.993；銅綠微囊藻，y=3548.449x-9.075，R2=0.999.

2.5.2 影響濃度范圍的確定

用重鉻酸鉀配置鉻貯備液2mg·L（離子濃度），過0.45μm濾膜備用.向滅菌后的100mL培養(yǎng)液中加入不同體積的重鉻酸鉀貯備液，轉(zhuǎn)接處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻，置于人工氣候箱培養(yǎng).每24h測(cè)定藻的吸光值，觀察藻對(duì)Cr6+的敏感度以及Cr6+對(duì)藻產(chǎn)生影響的濃度范圍，開始正式實(shí)驗(yàn).

2.6 正式試驗(yàn)

2.6.1 pH對(duì)藻種生長(zhǎng)的影響

自然水體的pH值范圍一般是中性偏堿，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH為7.0±0.2、8.0±0.2和9.0±0.2（以下簡(jiǎn)寫為pH=7.0、8.0和9.0），用HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH.接種一定量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻，每個(gè)pH設(shè)3個(gè)平行，置于人工氣候箱中，每隔24h測(cè)定藻的光密度值，計(jì)算72h的比生長(zhǎng)率.

2.6.2 pH對(duì)Cr6+毒性的影響

在pH為7.0、8.0和9.0的培養(yǎng)液中，加入不同體積的Cr6+貯備液，充分搖勻后接入一定量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻.設(shè)置Cr6+的處理濃度和一個(gè)空白，處理組的 Cr6+的濃度分別為 0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0和1.5mg·L（離子濃度），每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行.放入培養(yǎng)箱中，測(cè)定72h時(shí)藻的光密度值（OD），并計(jì)算Cr6+對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制率，以及 Cr6+產(chǎn)生效應(yīng)的 NOEC、LOEC、EC10和EC20值.

3 結(jié)果（Results）

3.1 不同pH條件下藻的生長(zhǎng)

表2比較了不同pH條件下，小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻在72h時(shí)的比生長(zhǎng)率.可見，小球藻在pH=7.0時(shí)生長(zhǎng)率達(dá)到最大，說明生長(zhǎng)最好，斜生柵藻和銅綠微囊藻在pH=9.0時(shí)生長(zhǎng)最好.

表2 不同pH下72h藻的比生長(zhǎng)率Table 2 The 72h specific growth rates of the alga at different pH levels

由圖2可見，在pH=7.0時(shí)，小球藻在48h和72h時(shí)的生長(zhǎng)顯著高于pH=8.0和9.0（p<0.01）；在48h和72h時(shí)，斜生柵藻在pH=9.0時(shí)生長(zhǎng)顯著高于pH=7.0（p<0.01），但與pH=8.0相比沒有達(dá)到顯著性差異；在72h時(shí)，銅綠微囊藻在pH=8.0和9.0時(shí)生長(zhǎng)顯著高于pH=7.0（p<0.01），且pH=9.0的生長(zhǎng)顯著高于pH=8.0（p<0.05）.

3.2 不同pH下Cr6+的毒性效應(yīng)

水體中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻可以發(fā)生相互的轉(zhuǎn)化，有研究表明隨著pH的增大，六價(jià)鉻的還原作用逐漸降低，當(dāng)pH≥6時(shí)，六價(jià)鉻的光還原反應(yīng)基本消失（鄧琳等，2008）.本工作中依據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（國家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì)，2006），采用二苯碳酰二肼法，測(cè)定反應(yīng)開始和結(jié)束時(shí)水體中的Cr6+的含量.結(jié)果顯示Cr6+基本沒有被還原.因此本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以被認(rèn)為都是Cr6+的毒性效應(yīng).

在72h時(shí)測(cè)定藻的光密度值，計(jì)算各個(gè)濃度Cr6+對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制率，以劑量-效應(yīng)關(guān)系作圖（見圖3），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出不同pH條件下的NOEC、LOEC、EC10和EC20，結(jié)果列于表3、表 4和表5.

表3 不同pH值下小球藻的NOEC、LOEC、EC10和EC20Table 3 The NOEC,LOEC,EC10and EC20of Chlorella vulgaris at different pH levels

表4 不同pH值下斜生柵藻NOEC、LOEC、EC10和EC20Table 4 The NOEC,LOEC,EC10and EC20of Scenedesmus obliquus at different pH levels

表5 不同pH值下銅綠微囊藻的NOEC、LOEC和EC20Table 5 The NOEC,LOEC and EC20of Microcystis aeruginosa at different pH levels

由圖3可見，對(duì)于小球藻而言，Cr6+在低濃度時(shí)產(chǎn)生了刺激效應(yīng)，當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到0.1mg·L-1，在pH=8.0時(shí)對(duì)小球藻產(chǎn)生了顯著的抑制作用；而pH=7.0和9.0時(shí)Cr6+對(duì)小球藻產(chǎn)生了刺激作用，且隨著濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)；當(dāng)Cr6+濃度達(dá)到0.5mg·L-1時(shí)，對(duì)小球藻產(chǎn)生的抑制率分別為1.33%、4.96%和 2.99%，Cr6+對(duì)小球藻的毒性在pH=7.0時(shí)最小，在pH=8.0時(shí)最大；對(duì)于斜生柵藻而言，Cr6+濃度達(dá)到0.5mg·L-1時(shí)，在pH=7.0、8.0和9.0條件下產(chǎn)生的抑制率分別為12.17%、8.02%和5.87%，Cr6+對(duì)斜生柵藻的毒性在pH=9.0時(shí)最小，在pH=7.0時(shí)最大；對(duì)于銅綠微囊藻而言，Cr6+濃度達(dá)到0.5mg·L-1時(shí)，在pH=7.0、8.0和9.0條件下產(chǎn)生的抑制率分別為 58.34%、55.78%和52.75%，Cr6+對(duì)銅綠微囊藻的毒性在pH=9.0時(shí)最小，在pH=7.0時(shí)最大.

由表3可見，pH=7.0時(shí)，Cr6+對(duì)小球藻的毒性效應(yīng)值NOEC、LOEC、EC10和EC20最大，這說明在pH=7.0時(shí)，Cr6+對(duì)小球藻的毒性效應(yīng)最小，而在pH=8.0時(shí)，效應(yīng)值最小，說明其毒性最大；同樣，由表4可見，pH=9.0時(shí)，Cr6+對(duì)斜生柵藻的毒性最小，pH=7.0時(shí)毒性最大；由表5可見，pH=9.0時(shí)，Cr6+對(duì)銅綠微囊藻的毒性最小，pH=7.0時(shí)毒性最大.以上結(jié)果表明，在藻的最適生長(zhǎng)pH條件下，Cr6+對(duì)藻的毒性最小，即在最適pH條件下，藻對(duì)Cr6+的抗性最大.

比較以上3個(gè)表中的結(jié)果，同樣在最適生長(zhǎng)pH條件下，毒性效應(yīng)值EC20大小順序?yàn)椋恒~綠微囊藻（pH=9.0）<斜生柵藻（pH=9.0）<小球藻（pH= 7.0）；同樣在生長(zhǎng)較差的pH條件下，毒性效應(yīng)值EC20大小順序?yàn)椋恒~綠微囊藻（pH=7.0）<斜生柵藻（pH=7.0）<小球藻（pH=9.0），這說明Cr6+對(duì)銅綠微囊藻的毒性要比對(duì)小球藻和斜生柵藻的大，即銅綠微囊藻對(duì)Cr6+更加敏感.

4 討論（Discussion）

由表2和圖2可見，小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻在不同pH條件下，生長(zhǎng)速度不同.藻類生長(zhǎng)與藻本身的生理特點(diǎn)以及溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽、其它生物、pH等諸多環(huán)境因素有關(guān)，水體pH是一個(gè)重要的生態(tài)因子，與藻類生長(zhǎng)關(guān)系密切.不同藻類有一定的pH適應(yīng)范圍，即使同一屬的兩種藻，在不同pH下，其生長(zhǎng)也可能有很大差別（劉春光等，2005）.水體pH主要從兩方面對(duì)藻生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，一方面改變環(huán)境酸堿度，酸性太強(qiáng)（H+濃度高）或堿性太強(qiáng)（OH-濃度高）都會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生傷害，只有在適宜的酸堿度范圍內(nèi)，藻細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)繁殖；另一方面水體pH是影響碳酸鹽平衡系統(tǒng)以及不同形態(tài)無機(jī)碳分配關(guān)系，從而對(duì)藻類生長(zhǎng)產(chǎn)生影響（許海等，2009）.有資料表明，小球藻的最適pH值為6.0~7.0（張麗君等，2001），斜生柵藻的最適pH值為9.0~10.0（許海等，2009），銅綠微囊藻的最適pH值為8.5~9.5（金相燦等，2004），這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

圖3比較了不同pH值條件下，Cr6+對(duì)小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻的抑制率.在不同的pH條件下，相同濃度的Cr6+對(duì)藻產(chǎn)生毒性作用不同，且有種類差異，表明pH對(duì)Cr6+的毒性效應(yīng)產(chǎn)生影響. Cr6+對(duì)不同藻產(chǎn)生的毒性強(qiáng)度不同，在較大濃度下，都產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且都隨著濃度的增大，抑制效應(yīng)增強(qiáng).結(jié)果表明，在藻的最適pH條件下，Cr6+的毒性最小，即在最適pH條件下，藻對(duì)Cr6+的抗性最大.且Cr6+對(duì)銅綠微囊藻的毒性大于小球藻和斜生柵藻的毒性，銅綠微囊藻對(duì)Cr6+更為敏感，這同許多研究結(jié)果一致（鄭春艷和張庭廷，2008;Ma,2005）.

重金屬對(duì)藻類的毒性作用取決于金屬元素的形態(tài)、濃度、環(huán)境因素和重金屬元素之間的相作用，也取決于實(shí)驗(yàn)藻種及藻類細(xì)胞的生理生化過程.其中影響重金屬毒性的環(huán)境因素主要有pH值、溫度、光照、溶氧及螯合劑等（高為和張燁，2009;姜彬慧和林碧琴，2000）.以往的研究多注意到水體pH的變化會(huì)影響金屬的化學(xué)形態(tài)，從而導(dǎo)致其毒性有所不同（Kim et al.,1999;Park et al., 2009;孔繁翔等，1997;Peterson,1990）.本研究發(fā)現(xiàn)即使Cr6+的形態(tài)在pH值為7~9的范圍內(nèi)無明顯變化，也會(huì)造成對(duì)不同藻種的毒性效應(yīng)不同，這說明藻本身的生理特性也是影響重金屬毒性的主要因素之一.本實(shí)驗(yàn)中，小球藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻的最適生長(zhǎng)pH分別是 7.0、9.0和 9.0，而Cr6+在最適pH條件下，對(duì)這3種藻的毒性分別也是最小，表明藻生長(zhǎng)較好時(shí)，對(duì)毒物的抗性較大.

一般在確定污染物的環(huán)境基準(zhǔn)時(shí)，只考慮對(duì)所選擇典型代表生物的毒效應(yīng)，很少一并考慮環(huán)境因素.但從生態(tài)學(xué)角度，環(huán)境因素的影響不可忽視.我國幅員遼闊，不同流域/區(qū)域水環(huán)境生態(tài)特征、水環(huán)境承載力等都有很大的差異（孟偉等，2006）.由于水生態(tài)體系的局域性特征如水文條件、氣候、群落的生態(tài)機(jī)構(gòu)等多種因素都會(huì)影響污染物在水環(huán)境中的物理、化學(xué)和生物過程，因而可能導(dǎo)致不同的生態(tài)效應(yīng).因此，在制定我國的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，要充分考慮到環(huán)境因子對(duì)污染物毒性的影響.

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