趙瑾，常學(xué)秀，*，吳程，何玉芹

1.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091

2.云南省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，昆明650034

1 引言（Introduction）

重金屬污染對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)的影響日益突出，且容易通過(guò)食物鏈產(chǎn)生生物積累和放大效應(yīng).藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要成分之一，其生消對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能能夠產(chǎn)生重要影響.水體中重金屬對(duì)水生生物的毒害作用早在20世紀(jì)50年代開(kāi)始就備受關(guān)注，相繼開(kāi)展了藻類與金屬相互作用的毒理學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)研究.大量的研究成果表明，當(dāng)水環(huán)境中的重金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)，就對(duì)藻類的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制作用，主要表現(xiàn)在：畸變?cè)孱惖募?xì)胞形態(tài)，阻止細(xì)胞分裂，破壞細(xì)胞內(nèi)含物，降低酶的活性等（吳紅艷等，2003;Aiken et al.,2003），并表現(xiàn)出隨重金屬濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)的總體趨勢(shì).由于光合作用是藻類等光合自養(yǎng)生物的重要生命過(guò)程，是決定其生長(zhǎng)和繁殖的最重要的生理基礎(chǔ)，因此研究其在污染條件下的變化和響應(yīng)，是揭示光合生物受害機(jī)理的重要內(nèi)容.大量研究表明，重金屬作用下藻類的光合作用受到抑制，光合放氧速率下降（Rodríguez et al.,2007），如 Lu等（2000）發(fā)現(xiàn) Hg對(duì)藍(lán)細(xì)菌的急性毒性主要是抑制了光合作用的光量子產(chǎn)量；3μmol·L-1的 As2O3溶液使魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）光合活性下降為對(duì)照的一半（康瑞娟等，2005）；Cd2+脅迫下橢圓小球藻（Chlorellaellip soidea）細(xì)胞的光合作用受到明顯抑制，光合放氧速率隨Cd2+濃度的增加而逐漸降低，葉綠素的生物合成受阻，葉綠素b對(duì)Cd2+更為敏感（李建宏等，2004）.但目前重金屬影響藻類（特別是形成水華的藍(lán)藻）光合作用的進(jìn)一步機(jī)理尚不十分清楚，而且在眾多的重金屬污染物中，對(duì)鎳元素的藻類生物學(xué)效應(yīng)關(guān)注比較少.以前的研究發(fā)現(xiàn)，鎳（Ni）是生物生長(zhǎng)必須的微量元素，但高濃度的Ni能對(duì)人類、動(dòng)物、植物等會(huì)產(chǎn)生毒害作用（Poulik,1997）.由于藍(lán)藻是藻型富營(yíng)養(yǎng)化水體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，重金屬脅迫對(duì)藍(lán)藻生消的影響及其機(jī)理研究對(duì)于揭示水華藍(lán)藻爆發(fā)的機(jī)制具有重要意義.

本文選取富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)的水華藍(lán)藻——銅綠微囊藻和藍(lán)藻研究模式藻種——集胞藻，研究實(shí)驗(yàn)室條件下Ni2+脅迫對(duì)銅綠微囊藻和集胞藻生長(zhǎng)的影響，并從藻液的光吸收曲線、光合色素（葉綠素a、藻籃蛋白、別藻藍(lán)蛋白）含量等指標(biāo)入手，探討了重金屬對(duì)藍(lán)藻生消的影響及其生理機(jī)制，為深入研究藍(lán)藻在重金屬脅迫下的生理生態(tài)效應(yīng)及其機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 藻種培養(yǎng)

本研究所用的藻種為銅綠微囊藻（M. aerugonisa）FACHB-905株、集胞藻（Synechocystis sp.）FACHB-680株，均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)（FACHB）.采用HGZ-145培養(yǎng)基，置于人工氣候箱恒溫（26±1）℃培養(yǎng)，光照周期為 12:12（h）.實(shí)驗(yàn)設(shè)定的 Ni2+處理濃度為5mg·L-1、10mg·L-1、15mg·L-1、20mg·L-1、25mg·L-1，以不加 Ni2+的 0mg·L-1組為對(duì)照.分別于處理24h、48h、72h測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.

2.2 藻細(xì)胞生物量的測(cè)定

參照閻海等（2001）的方法，使用UV755B型分光光度計(jì)，自處理開(kāi)始每隔24h測(cè)定藻液在663nm下的光密度（OD663nm）值表示其相對(duì)生物量.

2.3 藻細(xì)胞光譜特征的測(cè)定

采用周志剛和尹長(zhǎng)松（2002）的方法，取5mL藻液，使用TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），用HGZ-145空白培養(yǎng)基做參比，在室溫下掃描350nm~800nm范圍內(nèi)藻液的吸收光譜.

2.4 葉綠素a含量的測(cè)定

葉綠素a含量的測(cè)定參照王永紅等（2001）報(bào)道的方法.

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析.

3 結(jié)果（Results）

3.1 Ni2+脅迫對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

不同濃度Ni2+處理下M.aerugonisa的生長(zhǎng)狀況如圖1所示，不同濃度Ni2+處理下Synechocystis sp.的生長(zhǎng)狀況如圖2所示.由圖1可見(jiàn)，M. aerugonisa的生長(zhǎng)明顯受到Ni2+的影響.培養(yǎng) 24h后，藻細(xì)胞的生物量與Ni2+濃度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R=-0.735，p<0.01），即隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理濃度下M.aerugonisa的生物量一直呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明Ni2+對(duì)M.aerugonisa的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），在處理至24h時(shí)，各濃度Ni2+處理下Synechocystis sp.的光密度 OD663值分別比對(duì)照增加了 0.52%、1.72%、2.47%、2.86%，其生長(zhǎng)沒(méi)有受到顯著影響（p>0.05）.但隨處理時(shí)間的推移（48h、72h），Synechocystis sp.的生物量逐漸降低，表明 Ni2+處理 48h會(huì)對(duì)Synechocystis sp.的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用.

3.2 Ni2+對(duì)藍(lán)藻吸收光譜的影響

不同濃度Ni2+處理下M.aerugonisa的吸收光譜變化規(guī)律如圖 3所示，不同濃度 Ni2+處理下Synechocystis sp.的吸收光譜變化規(guī)律如圖4所示.從圖3、圖4可見(jiàn)，在350nm~800nm光譜范圍內(nèi)，兩種供試藻藻細(xì)胞均出現(xiàn)了3個(gè)吸收峰，其中約440nm處的波峰為葉綠素a在藍(lán)光區(qū)的吸收峰；約630nm處為藻藍(lán)蛋白的吸收峰；約680nm處為別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a在紅光區(qū)的吸收峰.在所有的濃度條件下，Ni2+處理使 M.aerugonisa和Synechocystis sp.藻細(xì)胞的光吸收值逐漸降低，說(shuō)明Ni2+抑制了藻細(xì)胞的吸光能力.其中 Ni2+處理24h即對(duì)M.aerugonisa的吸光能力產(chǎn)生明顯影響，而Synechocystis sp.則在處理至48h時(shí)才產(chǎn)生這種抑制作用.

采用SPSS 10.0軟件分析Ni2+濃度與3種光合色素Chla、PC、APC光吸收峰值的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表 1.由表 1可見(jiàn)，M.aerugonisa和 Synechocystis sp.的Chla、PC、APC光吸收峰值均與Ni2+處理濃度成顯著負(fù)相關(guān).其中藻藍(lán)蛋白（PC）與Ni2+濃度之間的負(fù)相關(guān)性最高，表明3種光合色素中受Ni2+影響最大的是PC，其次是APC、Chla.

表1 Ni2+濃度與銅綠微囊藻和集胞藻光合色素的光吸收強(qiáng)度相關(guān)性分析Table 1 Correlations between the concentrations of Ni2+and intensity of photosynthetic pigment of M.aerugonisa and Synechocystis sp.Cells

3.3 Ni2+對(duì)供試藍(lán)藻葉綠素a含量的影響

Ni2+處理下銅綠微囊藻葉綠素a含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，Ni2+處理下集胞藻葉綠素a含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖5可見(jiàn)，M.aerugonisa的葉綠素a含量與Ni2+濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.但處理24h時(shí)5~ 15mg·L-1的Ni2+對(duì)M.aerugonisa葉綠素a含量有一定刺激作用，分別比對(duì)照提高 2.13%、4.31%、4.61%，但尚未達(dá)到顯著水平（p>0.05）.隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素a的含量隨Ni2+濃度的增加而迅速下降.由圖6可見(jiàn)，在相同時(shí)間內(nèi)，不同濃度Ni2+處理后葉綠素a含量的變化差異顯著，隨著處理濃度的加大，Synechocystis sp.藻細(xì)胞葉綠素a含量也相應(yīng)減少，5~25mg·L-1范圍內(nèi)葉綠素a含量與Ni2+濃度呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R24h=-0.668，p<0.01;R48h=-0.691,p<0.01;R72h=-0.709,p<0.01）.

4 討論（Discussion）

在供試劑量的Ni2+處理下，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到抑制，隨著Ni2+濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯；在處理至24h時(shí)，集胞藻的生長(zhǎng)尚未受到Ni2+的抑制，但處理至48h后呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，且脅迫濃度越大、脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯，表現(xiàn)出明顯的“劑量-效應(yīng)”和“時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系，Carrieri等（2008）的研究也表明Ni2+能抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)，并導(dǎo)致葉綠素降解.光合作用是藻類等光合自養(yǎng)生物的重要生命過(guò)程，是決定其生長(zhǎng)和繁殖的最重要的生理基礎(chǔ)，葉綠素a（Chl a）、藻藍(lán)蛋白（PC）和別藻藍(lán)蛋白（APC）是藍(lán)藻常見(jiàn)的3種重要的光合色素，其中PC和APC統(tǒng)稱為藻膽蛋白，它們共同構(gòu)成了藍(lán)藻的捕光天線系統(tǒng)，光能在藻膽體中傳遞的順序?yàn)镻C→APC，最后傳給光合作用反應(yīng)中心 Chl a（Arteni et al., 2009）.藻膽體主要通過(guò)藻膽體大小、結(jié)構(gòu)及數(shù)量的改變對(duì)環(huán)境作出響應(yīng)（Reuter and Müller,1993），如氮饑餓能導(dǎo)致集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803藻膽體在相關(guān)基因控制下主動(dòng)降解（Sato et al., 2008）.有報(bào)道指出，在藍(lán)藻的類囊體膜上，由于藻膽體顆粒位于外表面，因而更易受到進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬離子的作用（李建宏等，1997）.根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3種光合色素對(duì)Ni2+脅迫的敏感性大小依次為PC＞APC＞Chl a，由此表明藻藍(lán)蛋白（PC）是Ni2+的首要作用位點(diǎn)，王山彬等（2002）的研究也得到了類似的結(jié)果.但本課題組針對(duì)水生植物化感克藻效應(yīng)及其機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，M.aerugonisa的APC對(duì)粉綠狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）分泌的化感物質(zhì)更為敏感、更易于受損，即APC是粉綠狐尾藻對(duì)M.aerugonisa光合系統(tǒng)的化感抑制靶位點(diǎn)（Wu et al.,2008）.這可能是由于不同環(huán)境因子對(duì)藻膽體的影響機(jī)制存在差異，且該過(guò)程受其它共存生態(tài)因子的影響和制約，如 Carrieri等（2008）發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度顯著地影響著Ni2+對(duì)極大螺旋藻（Arthrospira maxima）生長(zhǎng)及葉綠素含量的影響：高光通量（100μE·m-2·s-1）下0.17、1.7、3.4、和5.0mM Ni2+處理3天后導(dǎo)致藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、脫綠及黃化，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)，而在低光通量（40μE·m-2·s-1）下，4.0mM Ni2+在處理初期使得葉綠素略有下降，但12d后恢復(fù)到不加鎳的對(duì)照水平.

綜上所述，重金屬可以通過(guò)破壞藻細(xì)胞的捕光天線系統(tǒng)，阻斷藻膽蛋白對(duì)光電子的捕獲和傳遞，從而抑制光合作用，最終抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)和繁殖.而且隨鎳脅迫劑量的加大和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)藻葉綠素a含量不斷減少.光合色素含量和功能的降低必然導(dǎo)致其光合能力的下降，從而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致生物量不斷降低.

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