武圣江，宋朝鵬，許自成，王松峰，李富強(qiáng)，程傳策，宮長(zhǎng)榮*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部煙草類(lèi)作物質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

由于多種原因，烤煙生產(chǎn)上往往出現(xiàn)上部葉擴(kuò)展不佳，葉片偏厚，組織結(jié)構(gòu)緊密，在烘烤中調(diào)制不當(dāng)極易導(dǎo)致光滑煙的現(xiàn)象。而且，近年來(lái)的試驗(yàn)和調(diào)研表明，密集烤房烘烤的煙葉容易出現(xiàn)顏色淺淡、光滑等現(xiàn)象，致使油分不足，工業(yè)企業(yè)的反響尤為突出[1]。為切實(shí)解決這一問(wèn)題，我國(guó)在提高上部葉可用性方面進(jìn)行了較多的研究[2]。紀(jì)成燦等[3]認(rèn)為，提高采收成熟度，延長(zhǎng)40～45℃烘烤時(shí)間可顯著降低光滑煙比例。另外，有人通過(guò)對(duì)光滑煙葉外觀分選、化學(xué)品質(zhì)分析、單料煙評(píng)吸，提出光滑類(lèi)煙葉合理分組定級(jí)的原則[4-5]。但目前在密集烘烤中從細(xì)胞生理生化變化上探討上部光滑葉的形成機(jī)理尚不多見(jiàn)。本試驗(yàn)通過(guò)研究上部葉烘烤中細(xì)胞水解酶及主要組分變化規(guī)律，探討光滑煙葉形成的生理機(jī)制，為進(jìn)一步提高上部葉的可用性和優(yōu)化密集烘烤工藝提供新的依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于 2007―2008年在河南省伊川縣白元鄉(xiāng)王耆店村進(jìn)行，供試品種為煙草(Nicotiana tabacumL)新NC89，5月上旬移栽，種植行距120 cm，株距 50 cm。土壤堿解氮 49.52 mg/kg，速效磷 6.8 mg/kg，速效鉀145.31 mg/kg，pH為8.49。施純氮45.0 kg/hm2，m(N):m(P2O5):m(K2O)=1:2:3。規(guī)范化栽培管理，以上部葉(第16～18葉位)為試驗(yàn)材料，依據(jù)成熟標(biāo)準(zhǔn)，煙葉成熟時(shí)按照葉位單葉采收。

1.2 樣品制備

采用河南農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)計(jì)的電熱式溫濕自控密集烤煙箱烘烤，烘烤時(shí)裝煙密度為70 kg/m3，按照三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤。分別在煙葉烘烤的關(guān)鍵溫度點(diǎn)取樣兩份(烤前鮮樣；干球38℃，濕球35℃左右，煙葉變黃八成發(fā)軟；干球 42℃，濕球 36～37℃，煙葉黃片青筋主脈發(fā)軟；干球 48℃，濕球38℃左右，黃片黃筋小卷筒；干球54℃，濕球39℃左右，葉片全干大卷筒；烤后樣)，切去葉尖和葉基部，留葉中部分。一份用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定。另一份于烘箱中105℃下殺青5 min，在60℃下烘干、粉碎，過(guò) 60目篩，用于細(xì)胞壁成分的測(cè)定。各重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

煙葉細(xì)胞壁降解酶的提取液配制和纖維素酶活性的測(cè)定，參照Andrews和Li[6]的方法。煙葉水分含量的測(cè)定，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性和纖維素含量的測(cè)定，采用寧正祥[7]的方法。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性和果膠物質(zhì)含量測(cè)定，采用韓雅珊[8]的方法。

2 結(jié) 果

2.1 烘烤中細(xì)胞壁水解酶活性的變化

2.1.1 烘烤中煙葉細(xì)胞壁 PME酶活性變化 PME的作用是水解果膠分子中甲酯化的羧基，使果膠中高度甲酯化的糖醛酸殘基生成多聚半乳糖醛酸和甲醇，同時(shí)為PG的活動(dòng)提供了條件[9]。從圖1可以看出，烘烤中PME酶活性在38～48℃之間較高，尤其在42℃酶活性達(dá)到峰值，為34.61 U/kg(FW)。38～48℃之間較高的 PME活性能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，使細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)充分降解和轉(zhuǎn)化，不利于光滑煙的形成。水分含量在38～48℃之間損失約為32%，是水分損失較多的一個(gè)階段。

圖1 烘烤中PME活性的變化Fig.1 Changes of activity of pectin methylesterase during flue-curing process

2.1.2 烘烤中煙葉細(xì)胞壁PG酶活性的變化 PG是主要的果膠水解酶之一，能夠水解植物細(xì)胞壁及胞間層的果膠物質(zhì)[10]。從圖2可以看出，PG酶活性38℃后顯著升高，在42～54℃之間一直保持較高的酶活性，并在48℃達(dá)到峰值，為946.07 U/kg (FW)。相關(guān)性分析表明，PG與水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.951*，表明較高的PG活性可加速細(xì)胞壁的分解和煙葉水分的排出；PG與溫度顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.901*，表明PG活性受溫度抑制的影響較小(表1)。

圖2 烘烤中PG酶活性的變化Fig.2 Changes of activity of polygalacturonase during flue-curing process

2.1.3 烘烤中煙葉細(xì)胞壁纖維素酶活性變化 一般纖維素酶的最適溫度范圍為40～60℃，其活性的表達(dá)與細(xì)胞壁的降解密切相關(guān)[11]。從圖3可以看出，纖維素酶在38～48℃之間酶活性較高，尤其在42℃達(dá)到峰值，為183.29 U/g(FW)。纖維素的分解破壞了煙葉細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)含物互相融合，獨(dú)立區(qū)域被打破，從而發(fā)生復(fù)雜的生理生化變化，有利于內(nèi)部物質(zhì)的充分降解和轉(zhuǎn)化。相關(guān)性分析表明，纖維素酶與PME的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.979**，呈極顯著正相關(guān)(表1)。

圖3 中纖維素酶活性的變化Fig.3 Changes of activity of cellulase during flue-curing

2.2 烘烤中細(xì)胞壁主要組分含量的變化

2.2.1 烘烤中煙葉細(xì)胞壁果膠物質(zhì)的變化 果膠是細(xì)胞壁中膠層的主要組分，煙葉果膠質(zhì)含量集中在5%～9%之間[12]。從圖4可以看出，在變黃期和定色前期有大量的可溶性果膠生成，相反，原果膠含量逐漸下降；總果膠含量在整個(gè)烘烤中有逐漸下降的趨勢(shì)。可溶性果膠的生成在38℃以前增加最明顯；原果膠在 38℃以前和 42～48℃之間有明顯的降低；總果膠在48～54℃之間降低最明顯。相關(guān)性分析表明，原果膠與煙葉水分含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.909*；原果膠與可溶性果膠呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.936**；原果膠與PG顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.950*(表1)。

圖4 烘烤中果膠質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of pectin contents during flue-curing

2.2.2 烘烤中煙葉細(xì)胞壁纖維素的變化 纖維素是構(gòu)成煙葉細(xì)胞組織和骨架的基本物質(zhì)，煙葉中全纖維素含量集中在15%～25%之間，它隨著煙葉等級(jí)的下降而增加[12]。從圖5可以看出，纖維素含量在烘烤過(guò)程中呈逐漸下降的趨勢(shì)。纖維素含量在38～48℃之間明顯降低，尤其在42～48℃之間降低更加明顯，48℃后變化不是很大。相關(guān)性分析表明，纖維素與水分含量的相關(guān)系數(shù)為0.944**，呈極顯著正相關(guān)；纖維素與原果膠、總果膠的相關(guān)系數(shù)分別為 0.909*和 0.953**(表1)。

圖5 烘烤中纖維素的變化Fig.5 Changesof cellulose contents during flue-curing

表1 烘烤中煙葉細(xì)胞壁酶、組分、水分含量及溫度之間的相關(guān)性Table1 Correlation among cell wall enzymes, components, water content of tobacco leaves and temperature during flue-curing

2.3 烘烤中煙葉細(xì)胞壁酶、組分、水分含量及溫度之間的相關(guān)性分析

煙葉細(xì)胞壁酶活性不僅受水分含量的影響，同時(shí)還受溫度等因素的影響。由表1可知，溫度與PG酶活性呈顯著正相關(guān)；與纖維素、原果膠、水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。煙葉的水分含量與PG酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與原果膠呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；同時(shí)與纖維素的負(fù)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

在煙葉內(nèi)部 PME與纖維素酶的相關(guān)性也達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。在細(xì)胞壁成分中原果膠與可溶性果膠呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。而且，原果膠、總果膠與纖維素呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。PG酶活性變化與可溶性果膠的相關(guān)系數(shù)為 0.865，但不顯著(P＞0.05)；與原果膠達(dá)到顯著負(fù)相關(guān)水平，相關(guān)系數(shù)為-0.950*。但 PME與可溶性果膠、原果膠、總果膠的相關(guān)系數(shù)均小于0.6。

3 討 論

PME[9]、PG[10]及纖維素酶[11]在細(xì)胞壁降解中起著重要的作用，較高的酶活性能加速果膠的水解和促進(jìn)細(xì)胞生化反應(yīng)，進(jìn)而為防止光滑煙的形成提供了條件。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PME在 42℃酶活性達(dá)到最大值，它不僅參與了煙葉細(xì)胞壁的降解代謝，而且和煙葉軟化進(jìn)程及光滑煙的形成有關(guān)。酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵溫度為45～50℃[13]，而PG最高酶活性在48℃。PG酶活性的變化將會(huì)對(duì)煙葉棕色化反應(yīng)和外觀質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響，并且可能與密集烤房烤后煙葉顏色淡有關(guān)。纖維素酶活性在42℃達(dá)到最大值，較高的纖維素酶活性有利于破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，加速煙葉內(nèi)部生理生化反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化。相關(guān)性分析表明，纖維素酶與 PME呈極顯著正相關(guān)，表明二者在細(xì)胞壁物質(zhì)降解中密切相關(guān)。

細(xì)胞壁物質(zhì)含量高，其煙氣具有強(qiáng)烈的刺激性、嗆咳、澀口且枯焦氣和木質(zhì)氣重，影響煙葉吃味；適當(dāng)降低煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)含量，則能提高煙葉質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)果表明，在密集烘烤中可溶性果膠不斷生成，原果膠、總果膠和纖維素含量不斷降低。變黃期和定色中前期是果膠、纖維素含量變化最劇烈的階段，也是煙葉物質(zhì)含量損失最多的時(shí)期[13]。相關(guān)性分析表明，PG與原果膠呈顯著負(fù)相關(guān)，但PME與原果膠的相關(guān)性不顯著。而且，PG和總果膠和可溶性果膠的系數(shù)均大于與 PME的，這表明果膠(總果膠、原果膠及可溶性果膠)與 PG 的關(guān)系比果膠與PME的關(guān)系更密切，即PG更有利于水解細(xì)胞壁和抑制光滑葉的形成。

煙葉在密集烘烤中變黃、失水、塌架、衰老是由細(xì)胞壁物質(zhì)不斷降解引起的[14]。并且，細(xì)胞壁物質(zhì)的降解進(jìn)程與光滑煙的形成密切相關(guān)。烘烤中光滑煙的形成導(dǎo)致煙葉的品質(zhì)和可用性降低，究其原因可能是細(xì)胞壁酶活性受到限制，煙葉水分不適，細(xì)胞壁物質(zhì)水解不完全或很少，內(nèi)含物降解和轉(zhuǎn)化不充分，進(jìn)而導(dǎo)致光滑煙的形成[3]。

通過(guò)試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，密集烘烤中煙葉酶促反應(yīng)和煙葉衰老、脫水干燥進(jìn)程是緊密相連的。細(xì)胞壁物質(zhì)的降解及光滑煙的形成并不僅僅是細(xì)胞壁酶作用的結(jié)果，還與細(xì)胞壁內(nèi)酶的協(xié)同作用及各種成分的轉(zhuǎn)化有關(guān)。另外，目前對(duì)密集烤房與普通烤房煙葉烘烤細(xì)胞生理變化差異還缺少對(duì)比性的研究，并且尚不清楚細(xì)胞壁酶活性變化對(duì)密集烘烤中和烤后煙葉各種常規(guī)化學(xué)成分的影響，尤其對(duì)香氣物質(zhì)的影響，詳細(xì)的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

烘烤中可溶性果膠含量不斷增加，原果膠、總果膠和纖維素含量不斷降低，其中果膠(總果膠、原果膠及可溶性果膠)與PG的關(guān)系比果膠與PME的關(guān)系更密切，即PG更有利于水解細(xì)胞壁和抑制光滑葉的形成。根據(jù)細(xì)胞壁酶活性及組分在密集烘烤中的變化規(guī)律，分別在 38～48℃，尤其是在 42℃適當(dāng)延長(zhǎng)烘烤時(shí)間，創(chuàng)造適宜的環(huán)境條件，保持較高的細(xì)胞壁酶活性，促使酶降解細(xì)胞壁物質(zhì)及內(nèi)部大分子物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化，這不僅有利于降低細(xì)胞壁組分和抑制定色后期棕色化反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)也有利于細(xì)胞內(nèi)各種生理生化反應(yīng)的充分發(fā)生，防止光滑葉的形成，確保煙葉生產(chǎn)的質(zhì)量和效益。

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