吳新華， 丁 利， 李忠海， 張彥麗， 劉曉霞， 王利兵＊

（1.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004）

近年來(lái)，食品罐頭、嬰兒奶瓶、微波爐飯盒及其他許多食品接觸材料中都用到了雙酚A二縮水甘油醚（BADGE）、雙酚F二縮水甘油醚（BFDGE）等環(huán)氧樹(shù)脂作為內(nèi)涂層［1］。其中BADGE和BFDGE會(huì)在食品接觸材料的加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中向內(nèi)容物遷移，造成污染，并形成水合物、氯代物等衍生物［2－4］。有研究報(bào)道，微量甚至痕量的雙酚A及其環(huán)氧化合物即可能對(duì)動(dòng)物生理活動(dòng)、生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響［5］。鑒于其存在多種食品安全隱患，內(nèi)涂料中雙酚二縮水甘油醚及其衍生物遷移量的分析方法是各國(guó)食品安全檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。

多壁碳納米管（MWCNTs）是一種新興的以碳為基礎(chǔ)的納米材料，具有一系列新異的物理化學(xué)特性。由于MWCNTs較大的比表面積及其特有的疏水性和結(jié)構(gòu)，應(yīng)用MWCNTs為基質(zhì)進(jìn)行固相萃?。⊿PE）受到越來(lái)越多的關(guān)注［6，7］。

目前對(duì)雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量檢測(cè)的方法主要為高效液相色譜法（HPLC）［8，9］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS）［10］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）［11］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS／MS）［12］等。本文采用MWCNTs為SPE柱填料，采用HPLC－MS／MS分析食品接觸材料中的雙酚－二環(huán)氧甘油醚向內(nèi)容物的遷移量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)ABI公司）配有島津公司的高效液相色譜儀；SPE裝置（美國(guó)Supelco公司）；高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；多功能微量化樣品處理儀（湖南長(zhǎng)沙中訊電子工程研究所）。

叔丁基甲醚（MTBE）、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國(guó)Merck公司）；乙酸銨為色譜純（北京化工廠）；水為超純水。

MWCNTs（直徑20～30 nm，長(zhǎng)度5～10μm，廣東深圳納米港公司）；雙酚－二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品：BADGE、雙酚A（2，3－二羥丙基）甘油醚（BADGE· H2O）、雙酚A（3－氯－2－羥丙基）甘油醚（BADGE· HCl）、雙酚A（3－氯－2－羥丙基）（2，3－二羥丙基）醚（BADGE·H2O·HCl）、BFDGE、雙酚F雙（3－氯－2－羥丙基）甘油醚（BFDGE·2HCl）純度均≥95%（美國(guó)Sigma公司）；藠頭罐頭、蓮子罐頭、魚(yú)肉和牛肉罐頭購(gòu)自本地超市。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇定容至10 mL，配成1.0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4℃避光保存。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配成100 mg／L的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏避光儲(chǔ)存。取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇定容配1.0 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 MWCNTs SPE柱的制備

除去商品化的SPE小柱中的填充物，徹底清洗小柱和聚乙烯墊圈。干燥小柱和墊圈后，用墊圈封住小柱的底部，稱(chēng)取0.25 g MWCNTs于SPE柱中，然后用墊圈封住小柱頂部，壓緊MWCNTs，使其高度大約為1.8 cm。使用前先用5 mL甲醇、5 mL水進(jìn)行活化。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱(chēng)取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL MTBE，旋渦振蕩1 min，超聲提取20 min后，以7 500 r／min離心5 min，分離上清液。下層殘?jiān)儆? mL MTBE采用上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。將提取液置于多功能微量化樣品處理儀上40℃吹至近干，用5 mL甲醇－水（50∶50，v／v）溶解，脂肪含量較高的食品需再加2 mL正己烷，混勻后棄去正己烷層，待凈化。

1.4.2 凈化

將上述提取液加載到活化后的MWCNTs SPE小柱上，控制流速為1 mL／min，棄去流出液，再用5 mL水淋洗，棄去淋洗液。最后用5 mL甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v）洗脫，收集合并全部洗脫液，于多功能微量化樣品處理儀上40℃吹至近干，用甲醇－水（50∶50，v／v）定容至1 mL，過(guò)0.45μm濾膜，供HPLC－MS／MS分析。

1.5 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL C18柱（150 mm×2 mm，2.5μm）；柱溫為30℃。流動(dòng)相A為甲醇，B為含有0.1%甲酸的5 mmol／L醋酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～10 min，40%B～5%B；10～15 min，5%B；15～16 min，5%B～40%B；16～20 min，40%B。流速為0.25 mL／min。進(jìn)樣量為10μL。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；霧化氣壓力為413 kPa；輔助氣壓力為448 kPa；離子噴霧電壓為5 500.00 V；氣簾氣壓力為137 kPa；離子化溫度為500℃；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）模式。6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下檢測(cè)6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring detection of 6 exogenous endocrine disruptors

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

利用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，將每種質(zhì)量濃度為100μg／L的雙酚－二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源中，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰。結(jié)果表明，ESI＋電離模式下，目標(biāo)化合物全掃描的準(zhǔn)分子離子［M＋NH4］＋最理想。對(duì)該準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描（子離子掃描），得到離子碎片信息，獲得二級(jí)質(zhì)譜圖。然后對(duì)去簇電壓、碰撞氣能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最佳。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，目標(biāo)物的總離子流MRM色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，6種分析物離子選擇性好，峰形尖銳對(duì)稱(chēng)。

圖1 6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5μg／L）的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 6 bisphenol diglycidyl ethers（5μg／L）Peaks：1.BADGE·H2O；2.BFDGE；3.BADGE·H2O·HCl；4.BFDGE·2HCl；5.BADGE；6.BADGE·HCl.

2.2 提取溶劑的選擇

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，提取溶劑的選擇是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇、乙腈、MTBE和乙酸乙酯作為提取溶劑對(duì)雙酚－二環(huán)氧甘油醚提取效率的影響，用上述溶劑超聲提取罐頭食品中的雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率見(jiàn)圖2所示。由圖2可以看出，用MTBE作為提取溶劑，6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率最好，因此本實(shí)驗(yàn)采用MTBE作為提取溶劑。同時(shí)比較了超聲作用時(shí)間的影響，當(dāng)超聲作用15 min時(shí)，雙酚－二環(huán)氧甘油醚能充分提取。

圖2 不同溶劑提取罐頭食品樣品中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.2 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in canned foodstuffs by different extraction solvents

2.3 MWCNTs用量的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MWCNTs的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定影響，用量過(guò)少則不能完全吸附目標(biāo)物，用量過(guò)多則會(huì)影響上樣時(shí)的流速。實(shí)驗(yàn)中制備不同填充質(zhì)量的MWCNTs SPE小柱，MWCNTs用量從150 mg到 400 mg。稱(chēng)取幾份空白樣品各2.0 g并添加20 ng／g的標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4.1節(jié)所述步驟進(jìn)行前處理，分別上樣到上述SPE小柱，流速控制在1.0 mL／min，以6 mL甲醇－乙酸乙酯（50∶50，v／v）洗脫，回收率情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，250 mg MWCNTs已能完全吸附6種目標(biāo)物，用量過(guò)多不但回收率沒(méi)有增加，反而會(huì)影響上樣速率及洗脫效率。綜合考慮，選定最佳的MWCNTs用量為250 mg。

圖3 MWCNTs用量對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of MWCNTs dosage on recoveries

2.4 洗脫溶劑及其體積的優(yōu)化

當(dāng)添加20 ng／g待凈化提取液到活化的MWCNTs SPE小柱后，分別比較了甲醇、乙腈和乙酸乙酯洗脫效率，洗脫溶劑體積為6 mL，流速控制在1.0 mL／min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用甲醇洗脫時(shí)，BFDGE和BFDGE·2HCl的回收率不是很好，其余4種目標(biāo)物都能達(dá)到80%以上；乙腈洗脫時(shí)的回收率不如甲醇好；乙酸乙酯洗脫時(shí)BFDGE和BFDGE ·2HCl的回收率能達(dá)到80%以上，但是其余4種均比較低，因此采用單一的溶劑無(wú)法從MWCNTs柱上把目標(biāo)物全部洗脫下來(lái)。綜合比較3種溶劑的洗脫效率，甲醇和乙酸乙酯的洗脫能力剛好互補(bǔ)，因此采用甲醇和乙酸乙酯混合溶液作為洗脫溶劑。考察了采用不同體積比的甲醇和乙酸乙酯洗脫時(shí)對(duì)回收率的影響，結(jié)果（見(jiàn)圖4）表明甲醇和乙酸乙酯的體積比為60∶40時(shí)，各化合物的回收率最好。

圖4 甲醇比例對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of methanol volume proportion on recoveries

考察不同體積下洗脫液對(duì)回收率的影響，洗脫溶劑為甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v），流速控制在1.0 mL／min，不同洗脫溶劑體積對(duì)回收率的影響見(jiàn)圖5?？梢钥闯觯S著洗脫體積的增大，雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回收率雖然也不斷增大，但當(dāng)洗脫液體積大于5 mL時(shí)，回收率的增長(zhǎng)緩慢。綜合考慮溶劑體積和回收率，最終選定洗脫液體積為5 mL。

圖5 洗脫體積對(duì)回收率的影響Fig.5 Effect of eluent volume on recoveries

2.5 方法的線(xiàn)性范圍與檢出限

對(duì)6份空白藠頭樣品按1.4節(jié)所述步驟進(jìn)行提取凈化并吹干，向其殘余物中依次加入用甲醇配制成的1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和100.0μg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，充分溶解后得到系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)濾膜后進(jìn)行HPLC－MS／MS分析，以目標(biāo)物在MRM模式下的峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度（X，μg／L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。6種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD，S／N＝3）見(jiàn)表2。

表2 雙酚－二環(huán)氧甘油醚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（S／N＝3）Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r2）and LODs（S／N＝3）for 6 target compounds

2.6 方法的回收率與精密度

在2 g空白的藠頭基質(zhì)中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得藠頭樣品中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的含量分別為5、10、20μg／kg。按上述方法每個(gè)加標(biāo)水平下平行測(cè)定6份樣品，連續(xù)6 d重復(fù)操作，最終結(jié)果見(jiàn)表3。6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚在空白藠頭中的平均添加回收率范圍為78.6%～89.9%，日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%；通過(guò)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)該方法同樣適用于其他罐頭樣品的分析。

表3 藠頭樣品中6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚的添加回收率及精密度（n＝6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 6 bisphenol diglycidyl ethers in a garlic sample（n＝6）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法測(cè)定市售不同品牌的罐頭食品的色譜圖見(jiàn)圖6。其中1份魚(yú)罐頭樣品中BADGE·H2O檢出量為3.02μg／kg；1份蓮子罐頭樣品中BADGE ·H2O·HCl檢出量為2.23μg／kg。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化和改進(jìn)，建立了測(cè)定食品接觸材料中6種雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量的MWCNTs－SPE－HPLC－MS／MS方法。方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，測(cè)定結(jié)果可靠，以MWCNTs作SPE柱回收率更高，重現(xiàn)性更好，能滿(mǎn)足食品接觸材料中雙酚－二環(huán)氧甘油醚遷移量的分析要求，同時(shí)也為其他內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)提供了有利工具。

［1］ Pardo O，YusàV，León N，et al.J Chromatogr A，2006，1107（2）：70

圖6 實(shí)際樣品的MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of real samplesa.fish canned foodstuff；b.garlic canned foodstuff.

［2］ Cabado A G，Aldea S，Porro C，et al.J Agric Food Chem，2008，46：1674

［3］ Luo S L，Wu S L，Zhang C H，et al.Food Science（羅生亮，吳少林，張朝暉，等.食品科學(xué)），2009，30（7）：52

［4］ Leepipatpiboon N，Sae－Khow O，Jayanta S.J Chromatogr A，2005，1073（1／2）：331

［5］ Hu X W，Zhang W D，Liu Y Q.Food Science（胡向蔚，張文德，劉炎橋.食品科學(xué)），2006，27（4）：264

［6］ Min G，Wang S，Zhu H，et al.Sci Total Environ，2008，396（1）：79

［7］ Zhou Q X，Xiao J P，Wang W D.J Chromatogr A，2006，1125（2）：152

［8］ Nerín C，Philo M R，Salafranca J，et al.J Chromatogr A，2002，963（1／2）：375

［9］ Sun C L，Leong L P，Barlow P J，et al.J Chromatogr A，2006，1129（1）：145

［10］ García R S，Losada P P.J Chromatogr A，2004，1032（1／2）：37

［11］ Vílchez J L，Zafra A，González－Casado A，et al.Anal Chim Acta，2001，431（1）：31

［12］ Zhang C H，Luo S L，Wu S L，et al.Journal of Instrumental Analysis（張朝暉，羅生亮，吳少林，等.分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2009，28（6）：714