劉學(xué)湘, 潘揚(yáng), 蔣亞平, 楊英, 蔡江濤

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210029)

青木香發(fā)酵后總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量測(cè)定

劉學(xué)湘, 潘揚(yáng)＊, 蔣亞平, 楊英, 蔡江濤

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210029)

以靈芝、槐耳等20個(gè)真菌為菌種、青木香藥材為基質(zhì),運(yùn)用固體發(fā)酵技術(shù),在一定的條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),篩選出13個(gè)菌種能在青木香藥材上生長(zhǎng)良好,表明這些菌種能與藥材形成較好的發(fā)酵組合形成發(fā)酵品。采用反相 HPLC二元梯度洗脫法測(cè)定13種青木香發(fā)酵品中馬兜鈴酸Ⅰ(AA Ⅰ)的含量及紫外分光光度法(UV)測(cè)定這些發(fā)酵品中總馬兜鈴酸(TAA)含量。HPLC測(cè)定表明,13種青木香發(fā)酵品主要腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ均有不同程度的下降,其中有6種發(fā)酵品的馬兜鈴酸Ⅰ的下降率在50%以上;UV測(cè)定發(fā)現(xiàn),這些發(fā)酵品中總馬兜鈴酸含量均有所下降,下降率最高者為46.76%,最低者為7.61%;HPLC和UV綜合(加權(quán))分析表明,13種真菌(均以代號(hào)表示)對(duì)青木香腎毒性成分的降解能力由大至小依次排列如下:F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7。提示不同真菌發(fā)酵可在不同程度上降低中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和總馬兜鈴酸的含量。

青木香;真菌發(fā)酵;總馬兜鈴酸;馬兜鈴酸Ⅰ;含量測(cè)定

青木香為馬兜鈴科植物馬兜鈴的干燥根,具有平肝止痛,解毒消腫的作用,臨床上用于眩暈頭痛,胸腹脹痛,癰腫疔瘡,蛇蟲(chóng)咬傷等。2004年,SFDA取消了青木香的藥用標(biāo)準(zhǔn),處方和制劑中以土木香(菊科植物土木香或總狀土木香的干燥根)代替。土木香為藏藥,在植物來(lái)源、功能主治、化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面與青木香均有所不同,兩者不應(yīng)相互替代[1]。有鑒于此,如何去除青木香等含馬兜鈴酸類中藥材中腎毒性成分并保持其原有的藥效,一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前對(duì)此類藥物研究最多的為關(guān)木通,使用的手段有炮制[2]、復(fù)方配伍[3]和改變?nèi)胨幮问絒4]等,也有采用微生物發(fā)酵的方法[5],但對(duì)青木香的相關(guān)報(bào)道較少。作者前期研究以靈芝、槐耳等20個(gè)真菌為菌種、青木香藥材為基質(zhì),運(yùn)用固體發(fā)酵技術(shù),在一定的條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),篩選出13個(gè)菌種能在青木香藥材上生長(zhǎng)良好,表明這些菌種能與藥材形成較好的發(fā)酵組合形成發(fā)酵品(結(jié)果將另文發(fā)表)。作者建立反相高效液相法(HPLC)測(cè)定13種青木香發(fā)酵品中馬兜鈴酸Ⅰ含量,以及紫外分光光度法(UV)測(cè)定這些發(fā)酵品中總馬兜鈴酸含量,觀察不同真菌發(fā)酵對(duì)中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和總馬兜鈴酸含量的影響,旨在為探索發(fā)酵法對(duì)含馬兜鈴酸類中藥材的“去毒存效”奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與材料

Shimadzu LC-10A T高效液相色譜儀:日本島津公司產(chǎn)品;Waters 2695高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)沃特斯公司產(chǎn)品;UV-2401 PC紫外可見(jiàn)分光光度儀:日本島津公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB:上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;超凈工作臺(tái)403:江蘇無(wú)錫縣空氣凈化設(shè)備廠產(chǎn)品;隔水式電熱培養(yǎng)箱 PYX-DHS:上海醫(yī)療器械七廠產(chǎn)品;SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器:江蘇金壇國(guó)勝儀器廠產(chǎn)品;A E240電子天平:M ETTLER公司產(chǎn)品;202型電熱恒溫干燥箱:上海索普儀器有限公司產(chǎn)品;FW 80型微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī):齊家務(wù)科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

青木香藥材,購(gòu)自南京鹿江中藥飲片廠,批號(hào):20070728,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為馬兜鈴科植物馬兜鈴(A ristolochia debilisSieb.etZucc)的干燥根;馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品,購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110746-200305,純度大于98%;乙腈為色譜純(TED IA),自制重蒸水,其他試劑均為分析純。

20個(gè)真菌菌種均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所提供,其中13個(gè)菌種的代號(hào)分別如下:F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、F-6、F-7、F-8、F-9、F-10、F-11、F-12和 F-13。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵處理 按固體發(fā)酵的生產(chǎn)工藝進(jìn)行操作[6]。將青木香粉碎成粗粒(過(guò)10目篩),加適量水濕潤(rùn),p H自然,填裝試管,混合均勻,扎口,121℃高壓滅菌50 m in,冷卻,作為發(fā)酵基質(zhì)用;從菌種斜面上切取綠豆粒大小的一塊菌絲體連同培養(yǎng)基,移入發(fā)酵基質(zhì)的表面(兩者須有接觸),扎口,置于培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng),定期觀察并記錄生長(zhǎng)情況。發(fā)酵30 d后,取出,60 ℃下干燥24 h,備用。

1.2.2 HPLC法測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ含量 參照文獻(xiàn)方法[7],自行確定了馬兜鈴酸 Ⅰ二元梯度洗脫HPLC定量分析條件。

(1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn):色譜柱為 Hanbon C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)0.2%醋酸水溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫,0～ 25 m in,15%A→30%A;25～45 m in,30%A →50%A;45～55 min,50%A →60%A;55～75 min,60%A →80%A;75～80 min,80%A →15%A;流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;柱溫:30 ℃;運(yùn)行時(shí)間:80 m in,梯度平衡時(shí)間:10 m in。該條件下對(duì)照品峰與樣品中其他色譜峰基本達(dá)到基線分離,理論板數(shù)按馬兜鈴酸Ⅰ峰計(jì)算不低于15 000。

(2)對(duì)照品溶液的制備:稱取馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品4 mg,置10 m L量瓶中,加甲醇約7 mL,置水浴上微熱使溶解,冷卻至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,即得(每mL含馬兜鈴酸Ⅰ為0.4 mg)。

(3)線性關(guān)系的考察:吸取對(duì)照品溶液25、50、100、200和250μL,分別置1 m L量瓶中,加甲醇至刻度 ,搖勻 ,即得質(zhì)量濃度分別為 10、20、40、80、100 μg/mL的馬兜鈴酸Ⅰ溶液。照前述色譜條件分別進(jìn)樣10μL,測(cè)定,記錄峰面積值。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/m L)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:回歸方程為Y=3.74×106X– 13 916(r=0.999 5),馬兜鈴酸Ⅰ在10～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

(4)供試品溶液的制備:取干燥青木香發(fā)酵品(或藥材)2 g,粉碎(過(guò)60目篩),稱重,置于100 m L圓底燒瓶中,加體積分?jǐn)?shù)60%甲醇20 m L,浸泡30 min后,水浴回流1 h,過(guò)濾,濾液蒸干,殘?jiān)约状级ㄈ葜?0 mL,0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液供 HPLC分析。

1.2.3 紫外分光光度法測(cè)定總馬兜鈴酸含量

(1)線性關(guān)系的考察:量取馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.4 mg/m L)30,60,120,150,210 μL,分別置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻(質(zhì)量濃度分別為1.2,2.4,4.8,6.0,8.4μg/m L),在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸收度,以對(duì)照品吸收度A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(μg/m L)為橫坐標(biāo)C,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:回歸方程為A=0.1007C+0.001(r=0.999 2),馬兜鈴酸Ⅰ在1.2～8.4μg/m L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系[8]。

(2)供試品溶液的測(cè)定:吸取上述供試品溶液(2 g→50 m L)60μL,稀釋并定容至10 m L,混勻,以甲醇為參比溶液。在波長(zhǎng)250 nm處測(cè)定樣品吸光度值,標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總馬兜鈴酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌絲體生長(zhǎng)情況

按1.2.1發(fā)酵條件得到的13種真菌在青木香藥材上的發(fā)酵生長(zhǎng)情況詳見(jiàn)表1。

2.2 發(fā)酵前后 HPLC比較

發(fā)酵前后 HPLC比較見(jiàn)圖1。

2.3 發(fā)酵前后樣品中馬兜鈴酸類成分的含量變化

馬兜鈴酸Ⅰ的 HPLC測(cè)定結(jié)果和總馬兜鈴酸的UV測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表1。

圖1 青木香發(fā)酵前后的 HPLC比較圖Fig.1 HPLC results of Radix aristolochiae after and before fermentation

表1 青木香13種發(fā)酵品各指標(biāo)變化情況表Tab.1 The parameters of the thirteen fermented products

3 討 論

體積分?jǐn)?shù)選用甲醇-醋酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液以及乙腈與0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等5種不同體積分?jǐn)?shù)的醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫測(cè)定。結(jié)果表明:乙腈-醋酸水溶液條件下的色譜峰分離度、峰形、柱效等參數(shù)優(yōu)于甲醇-醋酸水溶液系統(tǒng);且上述提及的5種不同體積分?jǐn)?shù)的醋酸水溶液對(duì)色譜峰的影響并不大,考慮到流動(dòng)相p H值過(guò)低影響色譜柱的使用壽命,故采用乙腈-醋酸(體積分?jǐn)?shù)0.2%)水溶液的二元梯度系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定;還比較了馬兜鈴酸Ⅰ及其它組分在315 nm和250 nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸收,250 nm處檢測(cè)的靈敏度較高。

在同一發(fā)酵條件下,通過(guò)約30 d對(duì)菌絲體生長(zhǎng)情況的觀察,發(fā)現(xiàn)其中13種真菌在青木香基質(zhì)上生長(zhǎng)良好,菌絲體發(fā)育正常,表明這些菌種與青木香基質(zhì)相適應(yīng)。HPLC測(cè)定表明,這13種發(fā)酵品中青木香基質(zhì)中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ均有不同程度下降,其中有6種發(fā)酵品馬兜鈴酸Ⅰ的下降率在50%以上;其HPLC的化學(xué)指紋譜亦有不同程度的變化。通過(guò)LC-M S進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)這些發(fā)酵品除馬兜鈴酸Ⅰ以外,其他馬兜鈴酸類化合物如馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ等含量等均有不同程度的變化,且都出現(xiàn)原藥材所沒(méi)有的未知成分(結(jié)果將另文發(fā)表)。UV測(cè)定顯示,13種發(fā)酵品中總馬兜鈴酸含量均有所下降,下降率最高者為46.8%,最低者為7.6%;HPLC和UV綜合(加權(quán))分析結(jié)果證明,13種真菌(代號(hào))對(duì)青木香藥材中主要腎毒性成分的降解能力排列如下:F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7。

發(fā)酵是利用真菌中的多種酶使底物(包括中藥材)進(jìn)行各種各樣的化學(xué)反應(yīng),如氧化還原反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、去硝基反應(yīng)或甲基化反應(yīng)等而發(fā)生轉(zhuǎn)化。青木香中的主要毒性成分為馬兜鈴酸類化合物,而主要有效成分是揮發(fā)油類物質(zhì)[9]。作者通過(guò)13種真菌的固態(tài)發(fā)酵使馬兜鈴酸類化合物發(fā)生了不同程度的降解或轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到降低這類有毒成分含量的目的。至于青木香中揮發(fā)油類成分發(fā)酵前后的變化有待進(jìn)一步研究。

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Determination of Total Aristolochic Acids and Aristolochic AcidⅠin Radix aristolochiae after Fermentation

LIU Xue-xiang, PAN Yang＊, JIANG Ya-ping, YANG Ying, CAI Jiang-tao
(College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

With Radix aristolochiae as substrate,twenty fungi was test and 13 different fungi were found to be grow n on it.Compare with that of the control,the AAⅠcontent was decreased in those 13 fermentation product,and the AAⅠcontent in 6 fermentation product was lower than 50%,compared with that of the control. Similarly,the TAA contents were also detected to be decrease.Among of them,the highest and lowest rate of decline was 46.76%and 7.61%,respectively.After statistical analysis,the ability to decompose the nephro toxic substances in Radix aristolochiae of the 13 fungi was illustrated as follows(from the strong to the weak):F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7(the symbol of different fungi).Those results indicated that different fungi fermentation could efficient decreasethe nephrotoxic components in Radix aristolochiae.

Radix aristolochiae,fungi fermentation,total aristolochic acids,aristolochic acidⅠ,determination

R 282

A

1673-1689(2010)02-0201-05

2009-04-10

江蘇省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(06 KJB360083);江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目(2008)。

劉學(xué)湘(1973-),女,江西南昌人,講師,理學(xué)碩士,主要從事中藥生物技術(shù)研究。Email:cyg20020515@yahoo.com.cn

＊通信作者：潘揚(yáng)(1964-),男,江蘇揚(yáng)州人,理學(xué)博士,研究員,主要從事中藥生物技術(shù)研究。Email:y.pan2006@163.com

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(責(zé)任編輯:朱明)