周理志,劉建勛,常澤亮,謝 英,杜國豐,趙 靜,梅曉丹＊

(1.中石油塔里木油田分公司新疆庫爾勒塔里木指揮部油氣工程研究院,新疆庫爾勒 841000;2.大連百奧泰科技有限公司研發(fā)中心,遼寧大連 116025)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 從新疆塔里木油田樣品中分離純化的產(chǎn)表面活性劑的菌株B IT-TLM1。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4Cl 2.0,K2HPO41.5,KH2PO43.0,MgSO40.1,CaCl20.01,葡萄糖10,pH 7.5;②藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基：牛肉膏1,葡萄糖20,蛋白胨5,酵母膏0.2,瓊脂18,十六烷基三甲基溴化銨0.2,亞甲基藍(lán)0.01。

1.2 方法

1.2.1 B IT-TLM1菌株生長曲線的測定 從平板上挑取B IT-TLM1菌株的單菌落,接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,40℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液的表、界面張力,每隔2 h取4 mL發(fā)酵液在600 nm波長下測其OD值,繪制該菌的生長曲線。

1.2.2 紫外線誘變 取在40℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)20 h的B IT-TLM1的培養(yǎng)液(OD600=1.580)進(jìn)行梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,取100μL涂布于藍(lán)色凝膠平板[6],40℃靜置培養(yǎng)20 h,選取平板上菌落數(shù)為200～300個(gè)的稀釋濃度作為最佳的稀釋濃度。以最佳的稀釋濃度進(jìn)行平板涂布后將培養(yǎng)皿置于與紫外燈(40 W)相距40 cm處分別照射10、20、30、40、50 s,照射之后立即將平板放置暗處避光2 h,另設(shè)未經(jīng)紫外光照過的B IT-TLM1平板作為對照組,將對照組與試驗(yàn)組平板均于40℃靜置培養(yǎng)20 h,觀察對照組與試驗(yàn)組平板菌落數(shù),試驗(yàn)組再生菌落計(jì)數(shù)為B,對照組再生菌落計(jì)數(shù)為A,計(jì)算誘變致死率[7]：

1.2.3 誘變菌株的篩選 ①初篩：將菌株B ITTLM1紫外誘變后的再生菌落接種于藍(lán)色凝膠平板,40℃培養(yǎng)20 h,選取藍(lán)色凝膠平板藍(lán)色暈圈直徑比原始菌株B IT-TLM1大的菌株進(jìn)一步復(fù)篩;②復(fù)篩：將初篩后的菌株接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在40℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)20 h。將發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min除去菌體,上清液用濃HCl調(diào)pH至2.0,出現(xiàn)絮狀沉淀,4℃靜置過夜,10 000 r/min離心30 min收集沉淀,用pH 2.0的酸溶液洗滌1次,將該沉淀溶于NaOH溶液,使最終pH值為7.0,干燥后得到淺褐色疏松狀固體的表面活性劑粗品。純化時(shí),將粗品置二氯甲烷中抽提,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后于稀NaOH溶液中溶解,形成多泡液體,濾紙過濾后,濾液再次加HCl調(diào)pH至2.0,將得到的沉淀離心,該沉淀物去除殘留水分后即為純品[8],稱重,計(jì)算發(fā)酵液中每克菌體表面活性劑的產(chǎn)量,與對照組相比,篩選出高產(chǎn)表面活性劑的誘變菌株。

1.2.4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性測定 將篩選出的高產(chǎn)表面活性劑菌株在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7代,于第1代、第4代、第7代測定其產(chǎn)表面活性劑的能力,考察誘變菌株產(chǎn)表面活性劑性能的穩(wěn)定性。

1.2.5 碳源對誘變菌株產(chǎn)表面活性劑的影響在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加1%的糖蜜、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、半乳糖、固體石蠟6種不同的碳源,在40℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h,測定培養(yǎng)液中表面活性劑的產(chǎn)量,并以原始菌株B ITTLM1為對照,比較誘變前后菌株利用不同碳源產(chǎn)生物表面活性劑的能力[9]。

1.2.6 氮源對誘變菌株產(chǎn)表面活性劑的影響在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加0.2%的蛋白胨、牛肉膏、尿素、KNO3、NH4Cl、NH4NO36種不同的氮源,在40℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B ITTLM1為對照,比較誘變前后菌株利用不同氮源產(chǎn)生物表面活性劑的能力[10]。

最后，在表6的各個(gè)模型中我引入了最后一個(gè)變量——公民性，該變量是本次研究中的一個(gè)創(chuàng)新，旨在探究公民的社會(huì)責(zé)任感與社會(huì)距離之間的關(guān)系。通過因子分析發(fā)現(xiàn)，在研究之初所選擇的4個(gè)指標(biāo)中，由“您對地方人大的日常工作和決策的關(guān)注程度”和“您對居民/村民委員會(huì)日常工作和決策的關(guān)注程度”這兩個(gè)最高負(fù)荷的題項(xiàng)所構(gòu)成的測度比開始所選擇的4個(gè)題項(xiàng)構(gòu)成的測度更加可信。因此用這兩個(gè)題項(xiàng)構(gòu)成了一個(gè)新的變量“公民性”，用來測量城市居民社會(huì)責(zé)任感的高低，如表5所示。

1.2.7 鹽度對誘變菌株產(chǎn)表面活性劑的影響將菌株按照5%的接種量接種于不同鹽度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、8%NaCl,在40℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B IT-TLM1為對照,比較誘變前后鹽度對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響。

1.2.8 pH對誘變菌株產(chǎn)表面活性劑的影響 將誘變菌株按照5%的接種量接種于不同pH值的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,在40℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液中表面活性劑的含量,并以原始菌株B IT-TLM1為對照,比較誘變前后不同酸堿度對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響。

2 結(jié) 果

2.1 BIT-TLM 1菌株生長曲線

B IT-TLM1菌株生長延滯期較短,10 h即可進(jìn)入對數(shù)生長期,在20 h以后達(dá)到穩(wěn)定期,測定此時(shí)發(fā)酵液的表、界面張力分別為29.29和0.61 mN/m,可見20 h為B IT-TLM1的最佳培養(yǎng)時(shí)間(圖1),該研究用培養(yǎng)20 h的B IT-TLM1發(fā)酵液進(jìn)行誘變。

圖1 BIT-TLM1菌株生長曲線Fig.1 Growth curve for strain B IT-TLM1

2.2 紫外誘變BIT-TLM1再生株致死率曲線

利用紫外線對B IT-TLM1菌株進(jìn)行誘變處理,其致死率與照射時(shí)間的關(guān)系曲線見圖2。從圖2可以看出,紫外線的處理時(shí)間與致死率之間存在明顯的正效應(yīng)關(guān)系,隨著紫外線處理時(shí)間的延長,致死率逐漸升高。紫外線分別處理30 s和40 s時(shí),致死率分別為78.3%和92.6%,處理50 s時(shí),致死率為98.5%。因此,紫外線處理的時(shí)間控制在40 s可達(dá)到預(yù)期的致死率。

圖2 BIT-TLM1菌株紫外誘變的致死曲線Fig.2 Lethal curve ofUV mutagenesis for strain B IT-TLM1

2.3 高產(chǎn)表面活性劑菌株的篩選

將紫外誘變(紫外光照射40 s,致死率為92.6%)后的B IT-TLM1再生菌株(圖3、圖4)接種于藍(lán)色篩選培養(yǎng)基,40℃培養(yǎng)20 h,選取在篩選培養(yǎng)基上藍(lán)色暈圈直徑比原始菌株B IT-TLM1大的菌株共10株進(jìn)入復(fù)篩(圖5)。

圖5 紫外誘變后的菌落形態(tài)Fig.5 Colonial morphology after UV mutagenesis

將初篩后的10株誘變菌株在40℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h,按照1.2.3中②的方法計(jì)算表面活性劑產(chǎn)量,得到3株產(chǎn)量提高的菌株,標(biāo)號為UV-6、UV-8、UV-10。

2.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了檢測誘變菌株UV-6、UV-8、UV-10產(chǎn)表面活性劑的性狀是否穩(wěn)定,將上述3株菌與原始菌B IT-TLM1分別接入液體培養(yǎng)基中,連續(xù)培養(yǎng)7代,分別測定其表面活性劑產(chǎn)量(表1)。

表1 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 1 Genetic stability determination results ofmutant strains

由表1可知,UV-6與UV-8在連續(xù)傳代培養(yǎng)后產(chǎn)量不穩(wěn)定,而UV-10的遺傳性能比較穩(wěn)定。

2.5 碳源對誘變菌株UV-10產(chǎn)表面活性劑的影響

從圖6中可以看出,以糖蜜、蔗糖及固體石蠟為碳源時(shí),誘變菌株UV-10表面活性劑產(chǎn)量均比B IT-TLM1高,其中糖蜜和葡萄糖是較佳的碳源,產(chǎn)量比BIT-TLM1分別提高了9.74%和9.22%,表明單糖比二糖及多糖對菌株代謝產(chǎn)表面活性劑的能力要好,誘變菌株UV-10能利用固體石蠟產(chǎn)表面活性劑,其能力與蔗糖相當(dāng),為高含蠟油藏利用微生物增產(chǎn)提供了保障。

圖6 碳源對誘變菌株UV-10表面活性劑產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of carbon sources on the surfactant production of mutant strain UV-10

2.6 氮源對誘變菌株UV-10產(chǎn)表面活性劑的影響

圖7 氮源對誘變菌株UV-10表面活性劑產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of nitrogen sources on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖7中可以看出,添加不同的氮源,誘變菌株UV-10表面活性劑的產(chǎn)量均比B IT-TLM1高。其中以硝酸鉀為氮源時(shí),產(chǎn)量提高了5.66%;以無機(jī)氮源氯化銨為氮源時(shí)誘變菌株UV-10的表面活性劑產(chǎn)量為0.309 7 g/g菌體,比采用牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉在相同條件下更經(jīng)濟(jì),為在采油領(lǐng)域大規(guī)模應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);以有機(jī)氮源尿素為氮源時(shí)表面活性劑產(chǎn)量較低,但也比原始菌株產(chǎn)量(0.135 g/g菌體)提高了7.41%。

2.7 鹽度對誘變菌株UV-10產(chǎn)表面活性劑的影響

圖8 NaCl濃度對誘變菌株UV-10表面活性劑產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of NaCl concentration on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖8可以看出,原始菌株B IT-TLM1在1%NaCl濃度下表面活性劑的產(chǎn)量達(dá)到最大,為0.278 6 g/g菌體,而誘變菌株UV-10在2%NaCl下表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到最大,比原始菌株BITTLM1提高了17.21%,表明誘變菌株UV-10最佳耐受的鹽度為2%,繼續(xù)添加鹽會(huì)影響產(chǎn)量,NaCl濃度超過2%產(chǎn)量急劇下降,鹽濃度超過5%時(shí),菌幾乎不生長,高濃度的鹽會(huì)使微生物細(xì)胞脫水,代謝終止。隨著環(huán)境鹽度的改變,微生物要適應(yīng)這種環(huán)境必須對外界的滲透壓做出相應(yīng)的反應(yīng)[11],推測誘變后的菌株UV-10在5%的鹽度下仍能生存,是因?yàn)樗ㄟ^對自身的基因調(diào)控分泌了某些滲透壓保護(hù)劑,這可以從誘變后表面活性劑產(chǎn)量看出來。

2.8 pH對誘變菌株UV-10產(chǎn)表面活性劑的影響

圖9 pH對誘變菌株UV-10表面活性劑產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of pH value on the surfactant production of mutant strain UV-10

從圖9可以看出,誘變前后的菌株在5.0～9.0的pH值范圍內(nèi)均生長,且在pH 7.0左右產(chǎn)表面活性劑的能力最強(qiáng),原始菌株B IT-TLM1在pH 6.0時(shí)表面活性劑的產(chǎn)量為0.289 1 g/g菌體,而誘變菌株UV-10的產(chǎn)量在弱堿性pH 8.0下達(dá)到最佳,為0.309 7 g/g菌體,比誘變前提高了47.48%,經(jīng)過紫外誘變,菌株可在弱堿性條件下代謝產(chǎn)表面活性劑,但pH達(dá)到10.0時(shí)表面活性劑產(chǎn)量僅為0.040 9 g/g菌體。

以上結(jié)果表明誘變菌株雖然能夠耐受一定范圍的pH波動(dòng),但是pH過高過低會(huì)導(dǎo)致溶液中滲透壓發(fā)生變化,從而導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡遭到破壞,進(jìn)而對微生物的生長代謝產(chǎn)生抑制,嚴(yán)重的導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,pH 8.0為誘變菌株最適產(chǎn)表面活性劑條件。

2.9 誘變菌株UV-10產(chǎn)表面活性劑的初步定性分析

利用1.2.3中②的方法,將原始菌株B ITTLM1、誘變菌株UV-10的代謝產(chǎn)物進(jìn)行酸沉[12],提純后經(jīng)薄層色譜(TLC)分析,UV-10所產(chǎn)生的生物表面活性劑與茚三酮?jiǎng)┳饔煤箫@紫紅色(結(jié)果未示)[13],與標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果相對照,初步判定誘變菌株UV-10所產(chǎn)生的是一類脂肽類的生物表面活性劑。

3 討 論

為篩選出生物表面活性劑高產(chǎn)菌株,本試驗(yàn)對1株產(chǎn)表面活性劑的菌株B IT-TLM1進(jìn)行了紫外誘變選育,在藍(lán)色凝膠平板上通過兩步篩選及遺傳穩(wěn)定性研究得到1株高產(chǎn)表面活性劑的誘變菌株UV-10,在150 r/min,pH 8.0,40℃培養(yǎng)20 h,其最大產(chǎn)量達(dá)到0.309 7 g/g菌體,比原始菌株B IT-TLM1的產(chǎn)量(0.283 6 g/g菌體)提高了9.2%。此前,Lin等[14]在Bacillus lichenifor m isJF-2培養(yǎng)液中加入誘變劑,通過一系列的篩選,最后得到1株變異株Bacillus lichenifor m isKGL11,它產(chǎn)生的生物表面活性劑濃度為390 mg/L,是Bacillus lichenifor m isJF-2產(chǎn)生的生物表面活性劑濃度的12倍,而且生物表面活性劑種類相同。本實(shí)驗(yàn)采用紫外誘變選育,獲得了較好的效果,若結(jié)合其他誘變方法的使用,菌株產(chǎn)表面活性劑的能力有待于進(jìn)一步提高,同時(shí)這株從新疆塔里木篩選出來的菌株,其理化性質(zhì)、分類地位、所產(chǎn)生物表面活性劑的種類,對新疆微生物菌群分布研究也有重要意義,其相關(guān)的內(nèi)容尚需進(jìn)一步研究。

[1] Arvisf G,Johnsonm J.A glycolipid produced by Pseudomonas aeruginosa[J].J Am Chem Soc,1949,71：4124-4126.

[2] Gabriel a seydlova,Jaroslava svobodova.Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications[J].Central European Journal of Medicine,2008,3(2)：123-133.

[3] KappeliO,Walther P,Mueller M,et al.Structure of cell surface of the Yeast and its relation to hydrocarbon transport[J].Arch Microbiol,1984,138：279-282.

[4] Kim HS,Yoon BD,Choung DH,et al.Characterization of a biosurfactant,mannosylerythritol lipid produced from Candidasp.SY16[J].Applied Microbiological Biotechnology,1999,52：713-721.

[5] 宋紹富,張忠智,雷光倫,等.高效驅(qū)油菌Ⅰ的選育與室內(nèi)巖心模擬驅(qū)油研究[J].石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào),2003,16：31-35.

[6] 沈薇,楊樹林,寧長發(fā),等.藍(lán)色凝膠平板法篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌[J].南京理工大學(xué)學(xué)報(bào),2005,29(4)：486-490.

[7] 王慕華,孫文敬,郭金權(quán),等.紫外誘變原生質(zhì)體選育D-核糖生產(chǎn)菌株[J].工業(yè)微生物,2005,(1)：24-27.

[8] 張翠竹,張心萍,梁鳳來,等.1株地衣芽胞桿菌產(chǎn)生的生物表面活性劑[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,23：41-45.

[9] 盧國滿,劉紅玉,曾光明,等.生物表面活性劑產(chǎn)生菌犁頭霉菌(Absidia orchidis)的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(9)：1426-1432.

[10] 嚴(yán)平,朱永光,吳斌,等.降解煉油廢水菌株0297發(fā)酵條件的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2006,29(4)：22-24.

[11] Wood J M.Osmosensing by bacteria：signals and membranebased sensors[J].Microbiol Mol Biol Rev,1999,63(1)：230-262.

[12] Peypoux F,Bonmatin J M,Labbe H,et al.[Ala4]surfactin,A novel isoform from Bacillus subtilisstudied by mass and NMR spectroscopies[J].European Journal of Biochemistry,1994,224：89-96.

[13] 周俊,譚寧華.植物環(huán)肽的薄層化學(xué)識別新方法及其在植物化學(xué)研究中的應(yīng)用[J].科學(xué)通報(bào),2000,45(10)：1047-1051.

[14] Lin SC,MintonMA,SharmaMM,et al.Structural and immunological characterization of a biosurfactant produced byBacillus lichenifor m isJF-2[J].Appl Environ Microbiol,1994,60(1)：31-38.