陳 鎮(zhèn)， 李永強， 陳文榮， 辛德東， 郭衛(wèi)東

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

短柄櫻桃 (Cerasuspseudocerasuscv. Duanbing) 系中國櫻桃的優(yōu)良栽培品種之一[1].短柄櫻桃主產浙江，有自花結實性好、早果性好、豐產性佳、適應性強、果實大、成熟期早而集中等特點，現(xiàn)已成為中國南方櫻桃產業(yè)發(fā)展的重點品種，并于1992年通過省級品種認定，為中國櫻桃中通過省級認定的少數(shù)品種之一.

設施栽培能夠使果樹提前開花、結果，調節(jié)水果豐淡季、搶占水果市場，極大地提高果品的經濟效益.目前設施栽培中還存在很多問題，設施內的溫度控制，特別是花期的溫度對果樹正常開花、坐果的影響顯著.為了促進桃樹開花，夜溫應保持10～15 ℃，最低溫不宜低于5 ℃,從扣棚至開花坐果，晝溫逐漸升至20～25 ℃，以不超過25 ℃為宜[2].甜櫻桃在需冷量得到滿足后，棚內溫度開始時要求晝溫在14～16 ℃,最高不宜超過18～20 ℃，夜溫6～7 ℃最為適宜;開花期前后15 d要求晝溫16～18 ℃，最高不宜超過20～22 ℃，夜溫7～9 ℃最為適宜[3].說明各種果樹依照其固有的生物學特性，在各個特定的物候期需要一個適宜的溫度才能生長發(fā)育良好.短柄櫻桃作為中國櫻桃的優(yōu)良品種，在其設施栽培中對花期的溫度管理方面還沒有進行系統(tǒng)的研究.本實驗主要是在人工控制條件下，研究溫度對短柄櫻桃開花進程及相關酶活性的影響，以確定短柄櫻桃花器官發(fā)育的適宜溫度范圍，揭示極限溫度對花芽萌發(fā)的傷害機理,為科學制定設施栽培中花期溫度管理指標提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

實驗材料采自浙江省金華市金東區(qū)上汪村.2008年12月17日，短柄櫻桃需冷量滿足，結束自然休眠.在同一試驗田中隨機剪取7年生的長果枝(約30 cm)，放入盛有9 g/L蔗糖溶液的容器中，將枝條隨即分成6份，每份約70根長果枝，分別置于夜溫為10 ℃，晝溫為10,15,20,25,30和35 ℃的光照培養(yǎng)箱中，光周期晝/夜(12/12 h)光照強度為2 500 lx，相對濕度(RH)控制在50%～70%.

每4 d取不同溫度處理的花芽(自頂芽向下第2至第4節(jié)位的花芽)測定酶活性和丙二醛含量.由于不同溫度下花芽萌發(fā)的速度不同，35和30 ℃處理每4 d到達一個開花物候期，在1月6日已經達到初花期;而25,20,15和10 ℃ 4個溫度處理還未完全進入開花進程，故采用兩階段分別比較的方法.第1階段：6個溫度處理每4 d取材測定一次.第2階段:在此階段中,35和30 ℃處理的開花進程已基本結束，25,20,15和10 ℃ 4個溫度處理下各開花進程時間相差較大，為便于比較,此階段按照開花進程取材測定.

1.2 開花進程的觀察

開花進程按照以下標準判斷：

花芽膨大期：花芽開始膨大，鱗片錯開.

花芽開綻期(開放期)：鱗片裂開，露出綠色葉尖.

花序可見期：花芽外層鱗片脫落，中部出現(xiàn)卷曲狀蓮座葉，花序已可看見.

花序分離期：花梗明顯伸長，花蕾彼此分離.

初花期：全樹5%的花開放.

盛花期：50%花開放為盛花期.

1.3 POD 酶活性的測定

過氧化物酶(POD)活性按照文獻[4]的方法測定.提取液為pH 7.8的磷酸緩沖液(含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP));反應混合液為50 mL pH 6.0的磷酸緩沖液，其中含28 μL的愈創(chuàng)木酚和19 μL 30%的過氧化氫溶液.根據(jù)470 nm波長下吸光度的增加計算酶活性，以在470 nm波長下每分吸光度的增加定義為1個單位酶活性.

1.4 CAT 酶活性的測定

過氧化氫酶(CAT)活性通過測定H2O2在240 nm波長下的分解率[5]來表示.取植物樣0.1 g，用提取液(pH 7.8磷酸緩沖液和10 g/L的PVP)冰浴提取，6 000 r/min離心20 min后，取上清液,即為所需測定的酶液.取2個100 mL三角燒瓶，編號為1和2，各加入酶液1 mL和提取液9 mL，馬上向2號瓶中加入3.6 mol/L H2SO4溶液5 mL以終止酶活動，作為對照.將各瓶置于20 ℃水浴中保溫20 min，加入0.1 mol/L H2O2溶液5 mL，在水浴中保溫作用5 min；向1號瓶中加入5 mL 3.6 mol/L H2SO4溶液；再向2個瓶中各加入1 mL 200 g/L KI溶液，3滴100 g/L鉬酸銨溶液，5滴10 g/L淀粉指示劑后，用0.02 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定至藍色消失.

1.5 SOD酶活性的測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)法[6]測定.稱取植物樣0.5 g，用5 mL提取液(pH 7.8的磷酸緩沖液和10 g/L的PVP)冰浴提取，6 000 r/min離心20 min后，取上清液，即為所需測定的酶液.在試管中加入3 mL反應混合液(在54 mL 14.5 mmol·L-1的甲硫氨酸溶液中分別加入均以pH 7.8的磷酸緩沖液配制的3 μmol·L-1EDTA溶液、2.25 mmol·L-1NBT溶液和60 μmol·L-1核黃素溶液各2 mL)和20 uL酶液，混合后光照10 min，以反應混合液為對照迅速測定A560.1 U的SOD定義為使NBT光還原速率抑制50%所需要的酶活性.

1.6 丙二醛含量的變化

取不同溫度處理下的花芽測定有毒物質丙二醛(MDA)含量的變化.膜脂過氧化程度用丙二醛(MDA)含量表示.測定方法采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[7].稱取植物樣0.2 g，于液氮中磨成粉末，然后加入100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液2 mL研磨至勻漿，再加入8 mL TCA溶液進一步提取，提取物離心后取2 mL上清液與2 mL 6 g/L TBA溶液(用100 g/L TCA溶液配制)混合，混合物在90 ℃水浴加熱20 min，冰浴結束反應，反應液離心后取上清液測定在532,600和450 nm波長下的吸光度，MDA的濃度(單位:μmol/L)按

CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450

計算.

1.7 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250 法[8].

1.8 數(shù)據(jù)處理

各項指標重復3次測定，實驗數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析和t檢驗，用Orgin 7.0軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 溫度對開花進程的影響

不同溫度處理對短柄櫻桃開花進程的影響顯著(見表1).總體而言，隨著處理溫度的升高，開花所需的時間逐漸縮短.35 ℃處理4 d后花芽開始膨大，鱗片錯開，12 d后到達花序可見期，發(fā)育最快，但此后絕大多數(shù)花芽停止發(fā)育，10%的花芽繼續(xù)生長至花序分離期，但花柄未露出便停止生長，花蕾和未展開的萼片上有明顯的褐色灼傷痕跡，最后全部不能正常開花而脫落.30 ℃處理組與35 ℃處理組比較，在開花進程時間上基本吻合，兩者發(fā)育到花序可見期所需時間基本相同.在開花進程時間上，25 ℃處理組比20 ℃處理組提早2 d；但15和10 ℃處理組開花所需時間明顯長于其他各組，整個開花進程分別耗時66及75 d.

表1 溫度對短柄櫻桃開花進程的影響

2.2 溫度對花芽MDA含量的影響

為揭示極限溫度條件下短柄櫻桃花芽的生理代謝受脅迫的程度，本實驗測定了6個溫度處理下短柄櫻桃花芽中丙二醛(MDA)含量的變化，探討了不同溫度下膜脂過氧化作用的情況.

MDA是膜脂過氧化作用的產物，其含量可以揭示膜脂過氧化作用的程度,進而反映植物受逆境脅迫的程度.第1階段(見圖1)，35和30 ℃處理組基本上每4 d到達一個開花物候期，即12月21日、25日和29日,1月2日和6日分別為花芽膨大期、開綻期、花序可見期、花序分離期及初花期，而其余4個溫度處理還未完全進入開花進程.從處理開始至12月29日，6個溫度處理組的花芽MDA含量無顯著性差異(P>0.05)；在處理至12月29日后，30和35 ℃處理下的花芽(處于花序可見期)中MDA含量開始快速上升，而其他4個溫度下的花芽MDA含量變化比較平穩(wěn)，無顯著性差異(P>0.05).第2階段，雖然各處理溫度條件下短柄櫻桃開花進程所需的時間相差較大，但各進程階段花芽內MDA含量的變化具有明顯的規(guī)律性，即25 ℃處理組在花序可見期后MDA含量開始升高，并持續(xù)到初花期，而其他3個溫度處理組花芽中MDA含量變化平穩(wěn)，無特殊規(guī)律，也無顯著性差異(P>0.05).

圖1 不同溫度下短柄櫻桃花芽中MDA含量的變化

2.3 溫度對花芽POD,CAT和SOD活性的影響

超氧化物氧化酶(SOD)是植物抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員之一，在植物體內負責將O·-2歧化為O2和H2O2，以減緩葉綠素、蛋白質的降解，增強機體的抗逆性.由圖2可見，10,30和35 ℃ 3個處理組花芽中SOD的活性均是先上升后下降，35 ℃處理組的SOD活性最高，但高峰以后SOD活性又低于前兩者.其他處理組的SOD活性則一直保持著平穩(wěn)的狀態(tài).

由圖3可見，在逆境溫度下H2O2的積累激發(fā)了POD的活性.30和35 ℃處理組花芽中POD活性從12月25日開始持續(xù)上升.25 ℃處理組在花序可見期和花序分離狀態(tài)下POD活性達到高峰.

CAT活性的變化與SOD基本相似，如圖4所示，30和35 ℃ 2個處理組花芽的CAT活性前期上升，后期迅速下降;而25 ℃處理組在花序分離期CAT活性達到峰值,而后迅速下降.

圖2 不同溫度下短柄櫻桃花芽SOD活性的變化

圖3 不同溫度下短柄櫻桃花芽POD活性的變化

圖4 不同溫度下短柄櫻桃花芽CAT活性的變化

2.4 溫度對花芽可溶性蛋白含量的影響

不同溫度處理下，短柄櫻桃花芽中可溶性蛋白含量升高的時間與花芽萌發(fā)進程吻合(見圖5).在花芽萌發(fā)進程中，可溶性蛋白含量一直在升高，主要升高階段是在花序可見期至初花期.當花芽進入萌動時期，枝條活動旺盛，韌皮部中在休眠期積累的營養(yǎng)輸送到花芽中，因此花芽中蛋白含量迅速升高，以保證花芽萌發(fā)的正常進行.

圖5 不同溫度下短柄櫻桃花芽可溶性蛋白含量的變化

3 討 論

膜的穩(wěn)定性是維持細胞正常生命活動的基本條件.在高溫脅迫下，組織中的氧化物自由代謝失調引起膜脂過氧化作用增強，導致細胞膜透性增加等傷害的發(fā)生，MDA含量被廣泛用于指示植物細胞膜系統(tǒng)完整性及受脅迫的程度.研究表明:在雄性敗育的花器官中，脂膜的破壞比在可育花器中快得多；在育性表達的關鍵期，H2O2，R-，O2，OH-等含量上升，引起膜脂過氧化加劇，其產物MDA含量上升.在水稻[9]、小麥[10]、玉米[11]及油菜[12]等不育材料中都發(fā)現(xiàn)了較高的氧自由基和MDA含量.在處理14 d后,35和30 ℃處理短柄櫻桃花芽中MDA含量開始升高，25 ℃處理組在花序可見期MDA含量開始升高，說明極限溫度造成的膜脂過氧化作用導致細胞膜透性增加，失去其選擇性透過的功能.通過短柄櫻桃花芽萌發(fā)過程中MDA含量的變化可以看出,35，30和25 ℃處理短柄櫻桃均是在花序可見期后MDA含量開始快速上升的.

相關研究表明，高溫脅迫引起的膜脂過氧化過程中氧自由基O·-2，H2O2等有毒物質的產生速度與保護酶系統(tǒng)在高溫下的活性共同決定著植物的耐熱性.植物酶促防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT) 等是消除自由基的重要酶，它們可以減輕膜脂過氧化的程度，保持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性.POD被認為通過自身的消耗清除了因代謝失調引起的過多氧自由基，從而保護了細胞膜的結構，提高植物的耐熱性.研究表明,草地早熟禾在熱脅迫時過氧化物酶(POD)活性先下降后升高[13];司家鋼等研究發(fā)現(xiàn)不管是耐熱還是熱敏大白菜品種，其POD活性在高溫下均下降，耐熱強的品種POD活性變化較大[14].在正常條件下，SOD 等活性氧清除劑能有效地清除機體內破壞力極強的活性氧;在高溫脅迫下,花芽中SOD 活性下降，造成膜脂過氧化作用加劇，使膜系統(tǒng)進一步受到傷害.短柄櫻桃在高溫脅迫下(35，30和25 ℃處理)，花芽中的SOD和CAT活性均在花序可見期升至峰值，然后急劇下降，說明其活性受到抑制，使超氧化物自由基、過氧化氫等活性氧不能有效地清除，過剩的活性氧會攻擊大分子和生物膜，使膜脂過氧化作用增強，從而引起傷害.而POD的活性在脅迫發(fā)生后迅速上升，說明與傷害的程度呈正相關.

隨著晝溫的提高，短柄櫻桃的花期相應提前，高溫處理會對花藥發(fā)育的特定過程造成傷害.本研究已證明:在晝溫35，30和25 ℃條件下，花芽中MDA含量及抗氧化酶活性均在花序可見期變化較大.花序可見期鱗片進一步錯開、脫落，小花外層的包片也脫落，此時花剛露出，對外界環(huán)境適應性較差，對溫度較為敏感.所以,設施栽培中花期溫度管理應該從扣棚開始，晝溫不超過25 ℃，保持在20～25 ℃為宜，這樣能加快物候期的進程，提早開花，增加坐果率.

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