崔冬清孫鐵英黎 建黃秀清

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院,北京 100730

2衛(wèi)生部北京醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 100730 3衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年病研究所,北京 100730

氧濃度變化對銅綠假單胞菌生物被膜生成的影響

崔冬清1,孫鐵英2,黎 建3,黃秀清3

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院,北京 100730

2衛(wèi)生部北京醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 1007303衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年病研究所,北京 100730

目的研究氧濃度變化對銅綠假單胞菌生物被膜產(chǎn)生量的影響,探討密度感應(yīng)系統(tǒng)在生物被膜調(diào)控中的作用以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達和生物被膜形成的關(guān)系。方法將 23株銅綠假單胞菌臨床菌株在不同氧濃度環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)3 d,檢測生物被膜和藻酸鹽產(chǎn)生量,銀染色法觀察 ATCC27853產(chǎn)生胞外多糖的時間窗,實時定量多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)測定密度感應(yīng)系統(tǒng)中調(diào)控基因LasI和RhlI的表達,Western blot方法觀察Ⅲ型分泌系統(tǒng)的代表毒素胞外酶 S分泌情況。結(jié)果銅綠假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量 (R=0.455,P=0.000)及藻酸鹽產(chǎn)生量 (R=0.367,P=0.000)均與氧濃度變化呈顯著正相關(guān)。銀染色法結(jié)果顯示,高氧條件下胞外多糖合成時間縮短。實時定量 PCR結(jié)果顯示,LasI、RhlI的相對表達量與氧濃度 (R=0.025,P=0.794;R=-0.044,P=0.653)、生物被膜產(chǎn)生量 (R=0.001,P=0.990;R=0.011,P=0.909)和藻酸鹽產(chǎn)生量 (R=0.029,P=0.770;R=0.193,P=0.064)間無明顯相關(guān)性。Western blot結(jié)果表明,銅綠假單胞菌在氧濃度為 10%～30%條件下可分泌胞外酶 S,在高氧條件下不分泌胞外酶 S。結(jié)論高氧可促進銅綠假單胞菌生物被膜的產(chǎn)生。Las系統(tǒng)和 Rhl系統(tǒng)可能因為菌群數(shù)量處于低水平而未在生物被膜形成早期階段參與生物被膜的調(diào)控過程。生物被膜的產(chǎn)生增多可能抑制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達,使該菌毒力發(fā)揮受到限制。

銅綠假單胞菌;生物被膜;氧濃度;密度感應(yīng)系統(tǒng);Ⅲ型分泌系統(tǒng)

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2010.03.015

銅綠假單胞菌是院內(nèi)獲得性感染的重要致病菌之一,流行病學統(tǒng)計資料表明該菌院內(nèi)獲得性感染發(fā)病率遠高于社區(qū)獲得性感染[1-3],推測其原因可能與院內(nèi)患者免疫力低下及使用廣譜抗生素有關(guān)[4]。然而,單純的外源性因素并不能完全解釋銅綠假單胞菌院內(nèi)感染高發(fā)的原因,可產(chǎn)生生物被膜被認為是銅綠假單胞菌耐藥和逃避人體免疫攻擊的重要手段。藻酸鹽是生物被膜的重要組成成分,具有抑制中性粒細胞活性、保護銅綠假單胞菌的作用[5]。密度感應(yīng)系統(tǒng)是細菌協(xié)調(diào)群體生物學效應(yīng)的一種有效手段,但其在生物被膜形成中的調(diào)控作用目前爭議頗多。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是銅綠假單胞菌主要的毒力因素之一,在急性感染中可發(fā)揮重要作用,對于Ⅲ型分泌系統(tǒng)和生物被膜形成這兩種生物學行為的關(guān)系目前學術(shù)界也存在一些分歧。本研究觀察了氧濃度變化對銅綠假單胞菌生物被膜及藻酸鹽產(chǎn)生量的影響,探討了密度感應(yīng)系統(tǒng)在生物被膜調(diào)控中的作用以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達和生物被膜形成的關(guān)系。

材料和方法

銅綠假單胞菌菌株的來源 23株銅綠假單胞菌臨床株和標準菌株 ATCC27853由衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科細菌室提供,臨床株均為呼吸內(nèi)科等臨床科室住院患者痰標本培養(yǎng)分離得來。所有菌株均經(jīng)隨機擴增 DNA多態(tài)性基因分型法 (random amplified polymorphic DNA,RAPD)證實來源于不同克隆[6]。

菌株培養(yǎng) 采用改良的微板法培養(yǎng)菌株,具體為:過夜培養(yǎng)的菌液經(jīng)分光光度計 (UV-1601,日本島津)測定 570 nm吸光度,LB培養(yǎng)液調(diào)定菌液濃度為 0.1OD,24孔培養(yǎng)板中每孔加入 200μl菌液、1張無菌特氟龍濾膜 (PTFE,北京北化黎明分離技術(shù)公司)和 1 ml LB培養(yǎng)液,放入密閉培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 3 d[7]。每次培養(yǎng)持續(xù)通入 1種氧濃度的混合氣體 (含有氧氣和氮氣),氧氣濃度分別為 0、10%、20%、30%、40%、50%、60%。

被膜菌總蛋白量的測定 細菌連續(xù)培養(yǎng) 3 d后,PBS清洗濾膜上的浮游菌,加入細胞裂解液裂解細菌 20 min,超聲 6 s,12 000 g、4℃低溫離心 15 min,取上清用 Bradford法檢測細菌總蛋白量。

生物被膜產(chǎn)生量的檢測 細菌連續(xù)培養(yǎng) 3 d后,PBS清洗濾膜上的浮游菌,結(jié)晶紫染液 (法國梅里埃公司)染色濾膜 20 min,去離子水漂洗后加入 95%酒精脫色 10 min,脫色液用分光光度計測定 570 nm的吸光度,再用每株菌的總蛋白量校正生物被膜吸光度。

藻酸鹽產(chǎn)生量的測定 細菌連續(xù)培養(yǎng) 3 d后,PBS清洗濾膜上的浮游菌,加入 1.2 ml硫酸 /硼酸鈉混合物,100℃煮沸 5 min,加入 20μl 1%對-羥基聯(lián)苯溶液顯色,分光光度計測定 520 nm吸光度,通過藻酸鹽 (美國 Sigma公司)標準曲線換算黏附在濾膜上的藻酸鹽量,即為每株菌產(chǎn)生的藻酸鹽總量,最后用被膜菌總蛋白量校正。

不同氧濃度下菌株 ATCC27853胞外多糖產(chǎn)生時間窗的觀察 過夜培養(yǎng)菌株 ATCC27853,LB培養(yǎng)液調(diào)定菌液濃度至 0.1OD值。6孔培養(yǎng)板中每孔加入3 ml LB培養(yǎng)液和 1張無菌蓋玻片 (20 mm×20 mm×0.7 mm),并加入 200μl菌液放入 37℃孵箱孵育,每次持續(xù)通入含 1種氧濃度的混合氣體。每隔 1 h取出 1張蓋玻片進行 5%硝酸銀溶液染色。光學顯微鏡下若見灰黑色斑片狀,則可鑒定為細菌合成的胞外多糖。

不同氧濃度下 LasI和 RhlI表達的測定 將 23株銅綠假單胞菌臨床株以相同濃度的初始菌液分別在不同氧濃度環(huán)境下連續(xù)孵育 8 h,離心,留沉淀。采用 Trizol(美國 Invitrogen公司)法提取 RNA,再反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,以管家基因Rpsl為內(nèi)對照,熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng) (Real time polymerase chain reaction,Real time PCR)檢測LasI和RhlI表達。PCR體系、擴增參數(shù)參照 Power SYBR Green試劑盒 (美國 AB I公司)說明書。擴增LasI基因上游引物序列為 5-CAAGTTGCGTGCTCAAGTGT-3,下游序列為 5-GGGAAGGTGTTCTTCAGCAT-3;RhlI上游引物序列為 5-CTTGGTCATGATCGAATTGCTC-3,下游序列為5-ACGGCTGACGACCTCACAC-3;管家基因Rpsl上游引物序列為 5-CGGCACTGCGTAAGGTATGC-3,下游序列為 5-CCCGGAAGGTCCTTTACAC-3。采用相對定量公式 2-ΔΔCt計算各目的基因LasI和RhlI的 mRNA相對表達量:目的基因的量 =2-ΔΔCt,其中 Δ ΔCt=ΔCt(目的基因)-ΔCt(管家基因Rpsl)。

不同氧濃度下胞外酶 S分泌的測定 將 23株銅綠假單胞菌臨床株以相同濃度的初始菌液分別在不同氧濃度環(huán)境下連續(xù)孵育8 h,離心,取上清。蛋白經(jīng)高溫變性后,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離約 1 h,300 V、低溫 1 h轉(zhuǎn)至 PVDF膜,室溫封閉 1 h。分別與 1∶2 500雞抗 Exoenzyme S單克隆抗體 (英國 Abcam公司)4℃孵育過夜,漂洗后加入 1∶2 500 HRP標記的兔抗雞 IgG相關(guān)抗原抗體 (北京友誼中聯(lián)公司),室溫孵育 1 h,漂洗后于暗室中加入混合 ECL發(fā)光緩沖液,壓 X-Ray膠片,顯影、定影、膠片掃描。

統(tǒng)計學處理 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件,相關(guān)性分析采用 Spearman檢驗,組間差異性分析采用雙向方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

不同氧濃度條件下銅綠假單胞菌生物被膜產(chǎn)生量 當氧濃度為 50%時,生物被膜產(chǎn)生量達最高值[4.05 OD/(g·L)];趨勢性分析結(jié)果表明,隨著氧濃度升高,生物被膜產(chǎn)生量逐漸上升 (圖 1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,銅綠假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量與氧濃度呈顯著正相關(guān) (R=0.455,P=0.000)。差異性分析結(jié)果顯示,不同氧濃度下銅綠假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量間差異有統(tǒng)計學意義 (F=3.934,P=0.000)。

不同氧濃度條件下銅綠假單胞菌藻酸鹽產(chǎn)生量當氧濃度為 60%時,藻酸鹽產(chǎn)生量達最高值(85.22 mg/g蛋白);趨勢性分析結(jié)果表明,隨著氧濃度升高,藻酸鹽產(chǎn)生量逐漸升高 (圖 2)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,銅綠假單胞菌的藻酸鹽產(chǎn)生量與氧濃度呈顯著正相關(guān) (R=0.367,P=0.000)。差異性分析結(jié)果顯示,不同氧濃度下銅綠假單胞菌的藻酸鹽產(chǎn)生量間差異有統(tǒng)計學意義 (F=5.905,P=0.000)。

不同氧濃度條件下 ATCC27853產(chǎn)生胞外多糖的時間窗 氧濃度為 40%、50%或 60%時,ATCC27853培養(yǎng) 1 h即可出現(xiàn)銀染的胞外多糖;氧濃度分別為20%、30%時,菌株需培養(yǎng) 2 h以上才出現(xiàn)胞外多糖;氧濃度為 10%時,胞外多糖最早出現(xiàn)時間為 4 h;無氧培養(yǎng)條件下,菌株培養(yǎng) 8 h出現(xiàn)胞外多糖。

LasI和 RhlI表達與氧濃度、生物被膜產(chǎn)生量和藻酸鹽產(chǎn)生量之間的關(guān)系 相關(guān)性分析結(jié)果表明,LasI的相對表達量與氧濃度 (R=0.025,P=0.794)、生物被膜產(chǎn)生量 (R=0.001,P=0.990)和藻酸鹽產(chǎn)生量 (R=0.029,P=0.770)間無顯著相關(guān)性;RhlI的相對表達量與氧濃度 (R=-0.044,P=0.653)、生物被膜產(chǎn)生量 (R=0.011,P=0.909)和藻酸鹽產(chǎn)生量 (R=0.193,P=0.064)間也無顯著相關(guān)性。

不同氧濃度下胞外酶 S的分泌情況 當氧濃度為 10%時,菌株 15、16能夠分泌胞外酶 S(圖3A);在氧濃度為 20%時,菌株 1～5、7～10、15、16、19、23能夠分泌胞外酶 S(圖 3B、C、D);當氧濃度為 30%時,菌株 1、2、4、5、9、10、15能夠分泌胞外酶 S(圖 3E、F);當氧濃度為 0、40%、50%和 60%時,無菌株分泌胞外酶 S。

討 論

圖 3 不同氧濃度下胞外酶 S的分泌情況Fig 3 The secretions of exoenzyme S under different levels of environmental oxygen

生物被膜是細菌分泌的一種多糖復(fù)合物,覆蓋在細菌表面,可保護細菌免受人體免疫細胞的攻擊,并可通過限制抗生素的滲透等作用提高細菌耐藥性。細菌在人體內(nèi)產(chǎn)生生物被膜,導(dǎo)致細菌不易被清除而造成的反復(fù)感染被稱為生物被膜病,目前臨床上對于生物被膜病的治療方法十分有限[5]。藻酸鹽是生物被膜的重要組成成分,可增強細菌黏附性,促進生物被膜形成,提高細菌的耐藥性;并可直接抑制中性粒細胞和巨噬細胞的趨化及吞噬作用,對細菌同樣能起到保護作用[8]。

銅綠假單胞菌以往被認為是需氧菌。1986年,Bazylinski等[9]發(fā)現(xiàn)該菌在無氧條件下可利用含氮化合物進行脫氮作用產(chǎn)能并生長。Worlitzsch等[10]對比了在無氧和空氣氧條件下銅綠假單胞菌產(chǎn)生藻酸鹽量的差異,發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在無氧條件下產(chǎn)生的藻酸鹽更多。本研究則觀察了不同濃度氧對銅綠假單胞菌生物被膜及藻酸鹽產(chǎn)生量的影響,結(jié)果顯示,銅綠假單胞菌的生物被膜產(chǎn)生量及藻酸鹽產(chǎn)生量均與氧濃度變化呈顯著正相關(guān);當氧濃度為 50%時,生物被膜產(chǎn)生量達最高值;當氧濃度為 60%時,藻酸鹽產(chǎn)生量達最高值;提示高氧環(huán)境促進了生物被膜和藻酸鹽的產(chǎn)生。本研究中使用的高氧濃度分別為 30%、40%、50%、60%,最高氧濃度之所以選擇 60%,是因為臨床上氧療的安全范圍低于 60%,更高濃度的氧療容易導(dǎo)致氧中毒。此外,本研究還采用銀染色法光鏡下觀察了不同氧濃度條件下銅綠假單胞菌生成胞外多糖的時間窗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),越高氧濃度環(huán)境下合成胞外多糖所需要的時間越短,提示高氧可促進胞外多糖的合成,有利于生物被膜的形成。

為了探查密度感應(yīng)系統(tǒng)在生物被膜形成中的作用,本研究采用實時定量 PCR方法測定不同氧濃度條件下銅綠假單胞菌臨床株 Las系統(tǒng)和 Rhl系統(tǒng)中信號分子合成酶基因LasI和RhlI的表達情況,結(jié)果顯示LasI和RhlI的相對表達量與對應(yīng)菌株在同一條件下生物被膜和藻酸鹽產(chǎn)生量無顯著相關(guān)性。分析其原因可能是本研究是將 23株臨床菌株培養(yǎng) 8 h后提取 RNA、反轉(zhuǎn)錄,再進行實時定量 PCR測定目的基因表達,由于 8 h的時間段是處于生物被膜形成過程的早期,而密度感應(yīng)系統(tǒng)作用的發(fā)揮需要有一定數(shù)量菌群才能產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng),所以對于生物被膜形成的早期,由于菌體數(shù)量處于低水平,此時密度感應(yīng)系統(tǒng)可能不發(fā)揮主要作用。

為了觀察Ⅲ型分泌系統(tǒng)和生物被膜產(chǎn)生量的關(guān)系,本研究在不同氧濃度環(huán)境下培養(yǎng)了銅綠假單胞菌臨床株,并分離上清,檢測菌株分泌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的代表毒素——胞外酶 S的能力,結(jié)果顯示,23株銅綠假單胞菌臨床株只有在氧濃度為 10%～30%的條件下分泌胞外酶 S。推測低氧環(huán)境下可能菌體處于低代謝狀態(tài),導(dǎo)致胞外酶 S分泌下調(diào);而高氧環(huán)境雖然有利于生物被膜產(chǎn)生,但并不利于胞外酶 S分泌,提示當銅綠假單胞菌大量合成生物被膜時,Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達受到抑制,侵襲力下降。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示高氧環(huán)境有利于銅綠假單胞菌生長及其生物被膜和藻酸鹽產(chǎn)生,故筆者推測醫(yī)源性氧療可能促進了銅綠假單胞菌產(chǎn)生生物被膜和藻酸鹽,導(dǎo)致該菌在人體內(nèi)的耐藥和寄植,而這可能就是銅綠假單胞菌院內(nèi)高感染的原因之一。建議針對有銅綠假單胞菌感染高危因素的患者應(yīng)避免過高濃度的氧療,以免造成有利于銅綠假單胞菌寄植的環(huán)境。

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Effect of D ifferentLevels of Environmental Oxygen on the Biofilm Production ofPseudom onas aeruginosa

CU IDong-qing1,SUN Tie-ying2,L I Jian3,HUANG Xiu-qing3

1Graduate School,CAMS and PUMC,Beijing 100730,China2Department of RespiratoryMedicine,Beijing Hospital,Ministry of Health,Beijing 100730,China3National Institute of Geriatrics,Beijing Hospital,Ministry of Health,Beijing 100730,China

SUN Tie-ying Tel:010-85136242,E-mail:suntieying3@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the relationship among oxygen concentration,quorum sensing system,typeⅢsecretion system,and biofilm production ofPseudomonas aeruginosa.M ethods A total of 23 clinical strains ofPseudomonas aeruginosawere cultured at different levels of environmental oxygen for three days.Then biofilm mass and alginate were quantified.The expression levels ofLasIandRhlIwere detected by real time polymerase chain reaction(PCR).The secretion of exoenzyme Swas examined byWestern blot.ResultsBoth the biofilm mass(R=0.455,P=0.000)and alginate(R=0.367,P=0.000)were positively correlated with oxygen concentration.Real time PCR showed that the expression levels ofLasIandRhlIwere not significantly correlated with oxygen concentration(R=0.025,P=0.794;R=-0.044,P=0.653),the production of biofilm(R=0.001,P=0.990;R=0.011,P=0.909),or alginate(R=0.029,P=0.770;R=0.193,P=0.064).Western blot showed that the optimal oxygen concentration range for exoenzyme S secretion ofPseudom onas aeruginosaranged 10%to 30%.Conclusions Hyperoxia can promote the production of biofilm and alginate byPseudom onas aeruginosa.Las/Rhl system may not participate in biofilm production at the early stage due to the low bacteria amount.The increased production of biofilm may inhibit the expression of TypeⅢSecretion system and thus inhibit bacterial virulence.

Pseudomonas aeruginosa;biofilm;oxygen concentration;quorum sensing system;typeⅢsecretion system

Acta Acad M ed Sin,2010,32(3):310-314

孫鐵英 電話:010-85136242,電子郵件:suntieying3@hotmail.com

R378.99+1

A

1000-503X(2010)03-0310-05

2009-05-19)

·論 著·