劉 劉玲蓉陳名懋楊文智張其清

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程研究所天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室,天津 300192

2廈門大學 材料學院生物材料系生物醫(yī)學工程研究中心福建省生物醫(yī)學工程重點實驗室,福建廈門 361005

膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的熱變性過程

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程研究所天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室,天津 300192

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膠原蛋白;三螺旋結(jié)構(gòu);熱變性

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2010.03.023

氨基酸重復(fù)序列是很多纖維狀蛋白質(zhì)特征,這些序列促進每種蛋白形成自己的拓撲結(jié)構(gòu)[1]。膠原蛋白 Gly-X-Y肽段的重復(fù)出現(xiàn)使得膠原二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)特征性的聚脯氨酸Ⅱ型 (P2)結(jié)構(gòu),P2結(jié)構(gòu)進一步形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu),這是膠原蛋白區(qū)別于其他蛋白質(zhì)的特征性結(jié)構(gòu)[2]。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)在機體生命活動中發(fā)揮著極為重要的作用,膠原缺失及三螺旋結(jié)構(gòu)改變會導(dǎo)致多種人類疾病發(fā)生[3]。本研究以具有氨基酸重復(fù)序列的膠原模擬多肽 (collagen mimetic peptides,CMP),即 (Gly-Pro-Hyp)7作為膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)模型分子,采用圓二色譜和傅立葉紅外光譜兩種光譜學方法對其三螺旋結(jié)構(gòu)及熱誘導(dǎo)變性過程進行研究,旨在進一步認識膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)受溫度影響的相關(guān)機制。

材料和方法

材料和儀器 CMP(上海吉爾生化有限公司),D2O (青島騰龍微波科技有限公司),CaF2窗片(32 mm×3 mm,天津港東科技有限公司);JASCO J-810圓二色譜儀 (日本 JASCO公司),Nicolet IS-10系列傅立葉變換紅外光譜儀 (美國 Nicolet公司)。

圓二色譜分析 配制濃度為 0.2 g/L的 CMP重水稀溶液,將其注入 1 mm光徑的石英池,于 190～260 nm范圍內(nèi)進行掃描,各參數(shù)設(shè)定如下:分辨率0.1 nm,掃描速率 100 nm/min,狹縫寬度 1 nm,響應(yīng)時間 1 s,靈敏度 standard(100 mdeg),記錄結(jié)果為 3次掃描平均值。

傅立葉紅外分析 將 CMP溶于重水配制終濃度為 5 g/L的溶液,將 CMP溶液于 4℃放置 48 h后進行紅外光譜檢測。光譜采集采用 Nicolet公司液體變溫附件,窗片之間距離為 25μm,將 40μl樣品溶液注入 CaF2晶體窗片之間后密封。掃描條件設(shè)置為:掃描次數(shù) 64次,分辨率 2 cm-1,在不同溫度條件下測量 CMP溶液位于 1 700～1 600 cm-1的光譜。得到的譜圖在OM I NC軟件下進行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用溶劑峰差減和傅立葉去卷積等方法進行數(shù)據(jù)處理,對處理后紅外譜線進行高斯/洛侖茲擬合。

結(jié) 果

圓二色譜分析結(jié)果 20℃時,CMP正峰出現(xiàn)在約 225 nm處,負峰出現(xiàn)在約 198 nm位置;隨著溫度升高,正負峰強度均有所減少并發(fā)生紅移,負峰紅移幅度大于正峰 (圖 1)。225 nm處 CD值-溫度曲線在 30～50℃范圍內(nèi)發(fā)生明顯突躍;20℃時 CMP的圓二色譜譜峰正峰強度與負峰強度比值 (Rpn值)為0.104;升至 30℃以上時 CD譜峰型發(fā)生強烈改變,正峰和負峰強度都急劇減小,Rpn值也大幅度降低;50℃以后 Rpn值降低幅度減緩;80℃時降至 0.01;Rpn值-溫度曲線的突躍中點約為 43℃,與 225 nm處CD值-溫度曲線重疊效果良好 (圖 2)。CMP在冷卻過程中后其正負峰強度均有大幅度提高,負峰明顯藍移,CMP發(fā)生 “單體-三螺旋”轉(zhuǎn)變;4 h后整個譜型與加熱前相比幾乎一致,Rpn值由最初的 0.01升至 0.106(圖 3)。

傅立葉紅外光譜分析結(jié)果 CMP紅外光譜酰胺Ⅰ帶吸收結(jié)果顯示,1 645 cm-1和1 672 cm-1處有兩個明顯主峰,1 630 cm-1處有 1個肩峰;隨著溫度升高,1 645 cm-1處的吸收強度明顯降低,但沒有明顯峰位移現(xiàn)象發(fā)生,1 630 cm-1和1 672 cm-1處吸收強度降低幅度不大 (圖 4)。FTIR-溫度曲線顯示,15℃時 CMP在1 645 cm-1處具有最強吸收值 0.071,30℃以后吸收強度下降趨勢加快,60℃時吸收強度已降至 0.045,整個酰胺Ⅰ帶的吸收強度隨溫度升高逐漸降低,與圓二色譜所表示的熱變性曲線具有相同的突躍區(qū)間并重疊情況良好,可得出變性溫度 Tm≈42℃(圖 5)。FTIR反應(yīng)的 CMP復(fù)性結(jié)果顯示,冷卻過程中1 645 cm-1處的吸收強度逐漸增強,4 h后1 645 cm-1處吸收強度達到最大值 (圖 6)。對 CMP紅外譜圖進行溶劑峰差減、二階求導(dǎo)、去卷積和峰分辨擬合處理后結(jié)果顯示,CMP酰胺Ⅰ帶被擬合為 3個子峰,分別位于1 645 cm-1、1 630 cm-1和1 672 cm-1處 (圖 7)。

圖 7 CMP在重水溶液中的紅外實驗譜圖 (點)與紅外擬合譜圖 (粗線為疊加譜,虛線為分峰譜)

討 論

生物體內(nèi)組成蛋白質(zhì)的 20種氨基酸,除最簡單的甘氨酸不具有手性外,其余都是 L型,加之肽鍵的不對稱性,蛋白質(zhì)分子具有手性,也具有光學活性,其 CD光譜中在紫外區(qū)段有特征峰,可用于解析蛋白質(zhì)分子或多肽序列主鏈的構(gòu)象[4]。膠原蛋白的Rpn值通常被用來確定膠原蛋白的溶液構(gòu)象,正負峰強度比值變化在一定程度上能夠反映膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的變化[5]。由于 Rpn值能夠反映整個遠紫外區(qū)正、負兩峰的變化情況,比單獨依靠正峰強度變化能夠更真實地反映多肽鏈在熱變性過程當中發(fā)生的構(gòu)象變化,并且實驗證明 Rpn值-溫度曲線與CD值-溫度曲線重疊良好,因此利用 Rpn值-溫度曲線表示多肽鏈熱變性過程所反映的三螺旋結(jié)構(gòu)變化信息應(yīng)當更為全面。

由 CMP的 CD譜和 FTIR譜分析可知,在適當溫度下 CMP可發(fā)生 “單體-三螺旋”結(jié)構(gòu)的可逆變化。CMP在水溶液當中能組裝為高度有序的三螺旋結(jié)構(gòu)[6-7],并且其構(gòu)象具有溫度依賴性,高溫處理后的CMP能夠在適當條件下實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的可逆恢復(fù)。

氫鍵對于穩(wěn)定膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)具有重要作用,其中膠原蛋白肽鏈間的主要氫鍵作用力為 Gly-X-Y中 Gly酰胺基上的 H與相鄰另一條肽鏈 Gly-X-Y中 X上的羰基之間的氫鍵,膠原蛋白受溫度誘導(dǎo)的變性常伴隨著氫鍵的斷裂和三螺旋結(jié)構(gòu)喪失。然而由于膠原大分子氨基酸組成種類較多,氫鍵作用力關(guān)系復(fù)雜,不利于闡述 “結(jié)構(gòu)-作用力”的相關(guān)機制,本研究以合成的膠原模擬多肽 CMP為膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的模型分子,通過 FTIR研究其熱變性過程并分析穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)氫鍵作用力的相關(guān)信息,這對于研究膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)受溫度影響的相關(guān)機理具有重要指導(dǎo)作用。

羰基參與穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用,酰胺Ⅰ帶是三類羰基綜合作用的結(jié)果,每個羰基的紅外吸收變化都會引起酰胺Ⅰ帶的峰型變化[8-9]。酰胺Ⅰ帶吸收譜型的改變與羰基伸縮振動情況的變化有關(guān),由于序列中 3種氨基酸的羰基所處溶液環(huán)境不同,而氫鍵作用力對羰基伸縮振動影響較大,反映在紅外譜圖中應(yīng)當具有不同的紅外吸收譜型。針對這種情況,本研究對 CMP紅外譜圖進行了溶劑峰差減、二階求導(dǎo)、去卷積和峰分辨擬合處理,結(jié)果顯示CMP酰胺Ⅰ帶被擬合為 3個子峰,分別位于1 645 cm-1、1 630 cm-1和 1 672 cm-1處 , 并分別代表 Pro、Gly和 Hyp的羰基吸收情況[10],由于 Pro羰基對1 645 cm-1的紅外吸收貢獻最大,Pro對應(yīng)的鏈內(nèi)氫鍵作用力的變化情況反映在紅外譜圖上為1 645 cm-1處的吸收強度變化。

Doyle等[11]研究認為,三股螺旋之間通過氫鍵穩(wěn)定,其中最重要的氫鍵是 Pro的羰基與另一條鏈上Gly的氨基之間形成的 (CPOP…NGHG),CPOP…NGHG是參與形成三股螺旋內(nèi)氫鍵,Gly和 Hyp的羰基都朝向三股螺旋的外部,與溶液的水分子形成氫鍵 (分別為 CGOG…HwOw和 CYOY…HwOw)。由于1 645 cm-1處的紅外吸收對應(yīng) Pro羰基的伸縮振動情況,而 Pro主要參與鏈內(nèi)氫鍵作用,因此,隨著溫度升高,1 645 cm-1處的吸收強度大幅度減少,顯示Pro羰基子峰的吸收強度降低,CPOP…NGHG的數(shù)量減少,鏈內(nèi)氫鍵逐漸解離,發(fā)生三螺旋向單體的轉(zhuǎn)變[12]。Gly和 Hyp主要參與 CMP水分子之間氫鍵作用,因此1 630 cm-1和1 672 cm-1處吸收強度隨著溫度升高,降低幅度不大,說明三螺旋結(jié)構(gòu)的改變對于 CGOG…HwOw和 CYOY…HwOw的影響不是很大。以上分析表明,Pro的羰基與異鏈 Gly的氨基之間形成的 (CPOP…NGHG)是穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的主要作用力,利用紅外光譜能夠有效分析 CMP三螺旋結(jié)構(gòu)熱變性過程的結(jié)構(gòu)變化信息,并且與 CD相比能夠更確切地反映穩(wěn)定肽鏈構(gòu)象氫鍵作用力的變化情況。

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張其清 電話:022-87890868,電子郵件:zhangqiq@126.com

Q518.4

A

1000-503X(2010)03-0343-04

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目 (973計劃)(2006CB933300)

2009-05-11)

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