李燕,宋瑱,冷平,熊輝,何洋

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610019;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川 成都 610041)

近年來,肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,S.pn)對常用抗菌藥物的耐藥情況日趨嚴(yán)重,特別是對青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、復(fù)方磺胺甲惡唑以及氯霉素等3種以上抗菌藥物耐藥的多耐藥菌株(MDR)的出現(xiàn),使肺炎鏈球菌所致重癥感染的治療成為難題。篩選肺炎鏈球菌多耐藥相關(guān)DNA進(jìn)行分析,有助于肺炎鏈球菌多耐藥的分子機(jī)制研究,以及新的抗多耐藥菌株藥物靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)。抑制消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH)是一種消減雜交與PCR結(jié)合的簡單、快速分離差異基因的新技術(shù)[1]。經(jīng)過不斷改進(jìn)和完善,已成為目前分離新基因的主要方法,是篩選耐藥相關(guān)基因的有效手段。本研究以臨床分離的肺炎鏈球菌多耐藥菌株和抗生素敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對象,通過抑制消減雜交技術(shù)獲得與多耐藥相關(guān)的DNA片段,為進(jìn)一步研究肺炎鏈球菌多耐藥分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

肺炎鏈球菌多耐藥菌株09062407分離自四川大學(xué)華西醫(yī)院,K-B法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對四環(huán)素、阿奇霉素、氯霉素、克林霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑均耐藥。肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619由四川大學(xué)華西醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存并提供,為上述抗菌藥物敏感株。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)選擇性細(xì)菌基因組消減試劑盒購自Clontech公司,RsaⅠ酶購自MBI Fermentas公司,pEASY-T3克隆試劑盒購自全氏金公司,BM 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×PCR Master Mix、柱式DNA回收試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒、TP10感受態(tài)細(xì)胞購自博邁德公司,PCR擴(kuò)增儀為 Thermo公司產(chǎn)品,冷凍離心機(jī)為Beckman公司產(chǎn)品,電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

基因組DNA提取及RasⅠ酶切。采用改進(jìn)的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法[2]提取細(xì)菌基因組 DNA。分別將多耐藥菌株 09062407和ATCC49619基因組DNA用RsaⅠ酶切,酚/氯仿抽提,無水乙醇沉淀,調(diào)整DNA濃度為300 ng/μl備用,酶切效果良好方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制消減雜交采用PCR選擇性細(xì)菌基因組消減試劑盒,實(shí)驗(yàn)所用接頭及引物見表1。

表1 接頭及引物序列Tab.1 Adaptor and Primer sequence

以臨床分離多耐藥菌株基因組DNA為被檢方(tester),標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC 49619基因組DNA為驅(qū)動(dòng)方(driver)。將tester的RasⅠ酶切產(chǎn)物分別與接頭1、接頭2R以 T4DNA連接酶連接,16℃反應(yīng)過夜,然后分別以兩種連接產(chǎn)物為模板,以23SRNA作為檢查接頭連接效率的基因,分別用23SRNA上、下游引物以及23SRNA上游引物和接頭外側(cè)引物1分別進(jìn)行兩種接頭的連接效率檢測。接有兩種接頭的tester分別與酶切后過量driver在98℃變性1.5 min、63℃雜交1.5 h,立即進(jìn)入第二次雜交。兩組第一次消減雜交的體系混合后加入變性的driver,63℃雜交過夜。稀釋第二次雜交產(chǎn)物,以PCR引物1進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。第一次PCR產(chǎn)物以巢式引物1和巢式引物2R進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行PCR產(chǎn)物消減效率檢測。消減混合物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并成像。

消減雜交文庫的構(gòu)建。二次PCR純化后產(chǎn)物2μl與pEASY-T3 1μl進(jìn)行連接反應(yīng),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TP10感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)冰浴和熱激后,涂布于含X-gal、IPTG的氨芐青霉素平板,培養(yǎng)過夜后得到藍(lán)白單個(gè)菌落。隨機(jī)挑選多個(gè)白色菌落。應(yīng)用巢式引物l和巢式引物2R進(jìn)行PCR初步鑒定。

2 結(jié)果

2.1 RsaⅠ酶切、接頭連接效率分析

未經(jīng)RasⅠ酶切的基因組DNA存在5kb彌散帶,酶切后的產(chǎn)物彌散帶在0.1～2.0 kb,酶切效果良好;將酶切產(chǎn)物分別與接頭1、接頭2R連接后,以23SRNA作為檢查接頭連接效率的基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)連有接頭與未連接頭的23SRNA基因的熒光強(qiáng)度相差不大,兩者熒光強(qiáng)度之比小于4倍,連接效率＞25%,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)果見圖1。接頭連接的成功與否是消減雜交成敗的關(guān)鍵,如果連接效率＜25%,應(yīng)重新做連接實(shí)驗(yàn)。

圖1 接頭的連接效率分析Fig.1 Analysis of ligation efficiency

1:為以Tester1-1(連有接頭1)為模板,23SRNA上、下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;2:為以Tester1-1(連有接頭l)為模板,23SRNA上游引物和PCR引物l擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;3:為以Tester1-2(連有接頭2R)為模板,23SRNA上、下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;4:為以Tester1-2(連有接頭2R)為模板,23SRNA上游引物和PCR引物l擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;M為分子量標(biāo)準(zhǔn)

Lane 1:PCR products obtained using Tester1-1(Adaptor 1-ligated) as template with 23SRNA Forward and Reverse Primers;Lane 2: PCR products obtained using Tester1-1(Adaptor 1-ligated)as template with 23SRNA Forward and PCR Primer 1;Lane 3:PCR products obtained using Tester1-2(Adaptor 2R-ligated)as template with 23SRNA Forward and Reverse Primers;Lane 4:PCR products obtained using Tester1-2(Adaptor 2R-ligated)as templatewith 23SRNA Forward and PCR Primer 1;M:DNA marker.

2.2 抑制消減雜交結(jié)果

經(jīng)過兩輪消減雜交后的產(chǎn)物做兩次抑制性PCR,第一次PCR產(chǎn)物少,且彌散,第二次PCR后,差異片段大量富集,電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散分布帶,大小200～1 500 bp,其中有明顯富集的條帶。結(jié)果見圖2。

2.3 消減效率分析

圖3 消減效率檢測結(jié)果Fig.3 The results of subtraction efficiency analysis

消減效率分析以23SRNA管家基因在抑制性消減雜交產(chǎn)物中的豐度為參考,結(jié)果見圖3。從圖3可以看出,消減后的耐藥株在28次循環(huán)后才看到23SRNA產(chǎn)物,說明消減效率良好。以未消減的對照(1-4)和消減的二次PCR產(chǎn)物(5-8)為模板,用23S上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1、5:為33次循環(huán)產(chǎn)物;2、6:為28次循環(huán)產(chǎn)物;3、7:為23次循環(huán)產(chǎn)物;4、8:為18次循環(huán)產(chǎn)物;M為分子量標(biāo)準(zhǔn)

PCR was performed on subtracted(Lane1-4)and unsubtracted (Lane5-8)secondary products with the 23SRNA Forward and Re

verse Primers,1 and 5:33 cycles;2 and 6:28 cycles;3 and 7:23 cycles;4 and 8:18 cycles;M:DNA marker.

2.4 消減文庫構(gòu)建結(jié)果

第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后和pEASY-T3克隆得到經(jīng)藍(lán)白斑篩選的消減克隆庫。隨機(jī)挑取192個(gè)白色克隆應(yīng)用巢式引物l和巢式引物2R進(jìn)行PCR后有155個(gè)克隆(陽性克隆的比例達(dá)80.7%)能擴(kuò)增出單一片段,大小200～800 bp不等,圖4顯示其中9個(gè)克隆進(jìn)行 PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的片段情況。

圖4 菌落PCR結(jié)果Fig.4 The results of clonely PCR products

3 討論

國內(nèi)研究顯示我國肺炎鏈球菌多耐藥情況十分嚴(yán)峻,如上海地區(qū)2008年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)的監(jiān)測結(jié)果顯示:568株兒童非腦膜炎肺炎鏈球菌中對青霉素不敏感率達(dá)21. 5%,對紅霉素和克林霉素耐藥率則可達(dá)93.1%～97.8%,復(fù)方磺胺甲惡唑85.3%[3,4]。目前已知肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥機(jī)制主要是通過細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白基因突變,從而改變細(xì)胞壁上高分子量青霉素結(jié)合蛋白(PBP)結(jié)構(gòu),減少其對抗生素分子的親和力而產(chǎn)生;對大環(huán)內(nèi)脂-林可酰胺-鏈陽菌素類(MLS)藥物的耐藥機(jī)制主要是erm基因介導(dǎo)的核糖體甲基化修飾,可明顯降低細(xì)菌與MLS類的結(jié)合能力以及主動(dòng)泵出基因mef介導(dǎo)的主動(dòng)外排作用;對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要是由于2種拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA轉(zhuǎn)旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ活性位點(diǎn)的共同改變[5,6]。但是否存在多耐藥相關(guān)基因及其他耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。比較耐藥株與敏感株之間的基因組差異,無疑對鑒定那些只在耐藥株中存在的可能與耐藥相關(guān)的基因區(qū)域有很大幫助,可以對肺炎鏈球菌耐藥機(jī)制的深入研究開辟一條新途徑。

抑制消減雜交技術(shù)是由Diatchenko建立的一種消減雜交與PCR結(jié)合的簡單、快速分離差異基因的新技術(shù)。其運(yùn)用雜交動(dòng)力學(xué)原理,即豐度高的單鏈DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA,從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡;抑制PCR則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn),使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),無法作為模板與引物配對,選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增,從而使目的基因得到富集、分離,在一次抑制消減雜交反應(yīng)中,可同時(shí)分離成百的差異基因,實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因群之間的完整對比。因而,抑制消減雜交具有高特異性、高靈敏度、高效率等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過Akopyants等[7]對抑制消減雜交技術(shù)的改良,用于細(xì)菌基因組比較分析,為病原體中未知基因的篩選和微生物基因組差異、分子進(jìn)化的研究提供了重要的技術(shù)手段。目前,抑制消減雜交已用于細(xì)菌致病基因分離與鑒定[8]、細(xì)菌毒力差異及細(xì)菌種屬進(jìn)化關(guān)系的研究[9,10]等。

本次實(shí)驗(yàn)中以臨床分離的多耐藥菌株基因組DNA為被檢方,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49619基因組DNA為驅(qū)動(dòng)方,通過抑制消減雜交,剔除了相同基因片段,而使耐藥株與敏感株間差異片段大量富集,電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散狀分布DNA條帶,大小200～1 500 bp,這些差異強(qiáng)化帶可能包含有被檢菌獨(dú)有而參考菌缺如的片段,即與多耐藥相關(guān)的DNA片段。將這些DNA片段富集后通過與pEASY-T3載體連接得到消減文庫,隨機(jī)挑取192個(gè)克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后有155個(gè)克隆能擴(kuò)增出單一的DNA片段,大小200～800 bp不等,提示這些陽性克隆可能插入了高特異性的目的片段,可進(jìn)一步通過克隆雜交、測序、基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)位點(diǎn)及序列預(yù)測等生物信息學(xué)方法探尋肺炎鏈球菌多耐藥相關(guān)基因及機(jī)制。

[1] Diatchenko L,Lau YFC,Campbell AP,et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probe and libaries[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(5):6025-6030.

[2] 王關(guān)林.植物基因工程[M].第2版.北京:科學(xué)出版社, 2002:742-742.

[3] 朱德妹,汪復(fù),張嬰元,等.2008年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2009,9(6):401-411.

[4] 黃義山,劉淼,方莉,等.肺部銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌感染者臨床療效評價(jià)[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,5(2): 155-157.

[5] 徐敏,張建華,藏國慶.肺炎鏈球菌對抗菌藥物耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國感染與化療雜志,2008,8(2):152-156.

[6] 張?jiān)谕?肺炎鏈球菌耐藥趨勢及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際兒科學(xué)雜志,2007,34(1):40-42.

[7] Akopyants NS,Fradkov A,Diatchenko L,et al.PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(10):13108-13113.

[8] Dai J,Wang S,Guerlebeck D,et al.Suppression subtractive hybridization identifies an autotransporter adhesin gene of E. coli IMT5155 specifically associated with avian pathogenic Escherichia coli(APEC)[J].BMC Microbiol Antimicrob, 2010,10:236-239.

[9] Williams HL,Turnbull L,Thomas SJ,et al.A diagnostic PCR assay for the detection of an Australian epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2010,9:18.

[10] Park HK,Lee SJ,Yoon JW,et al.Identification of the cpsA gene as a specific marker for the discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci[J].J Med Microbiol,2010:59(Pt10):1146-1152.