陳金國 徐國興 白 月 徐 巍 郭 健

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化探討

陳金國 徐國興 白 月 徐 巍 郭 健

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所

目的：探討體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞的能力。方法：用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓MSC細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后，利用光感受器細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)MSC細(xì)胞14 d。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Rt-PCR觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否表達(dá)視紫紅質(zhì)（Rhodopsin）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）。結(jié)果：誘導(dǎo)細(xì)胞14d后即可見有神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)，實驗組MSC的Rhodopsin表達(dá)率為35.1%±6.2 %，而對照組中無Rhodopsin陽性的細(xì)胞, 實驗組MSC的NSE表達(dá)率為33.6%±4.0 %，對照組為10.6%±5.0%, 實驗組MSC的GFAP表達(dá)率為9.6%±1.5 %，對照組為13.7%±3.0 %。RT-PCR鑒定結(jié)果分析示實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表達(dá)，而對照組的只表達(dá)GFAP和NSE，未見Rhodopsin條帶。結(jié)論：體外培養(yǎng)的rMSC，經(jīng)過視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞培養(yǎng)上清液導(dǎo)，可以分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 光感受器細(xì)胞 誘導(dǎo)分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性成體干細(xì)胞，它具有兩項干細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特性：自我更新 (self-renewa1)能力及多向分化潛能。1968年, Friedenstein[1]等學(xué)者首先報告骨髓中存在一種細(xì)胞具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,他們認(rèn)為這種細(xì)胞可能是間充質(zhì)細(xì)胞的前體。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，MSC具有向中內(nèi)外胚層組織細(xì)胞分化的能力 ,可以在體外被誘導(dǎo)分化為肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[2, 3]。近年來，BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化的研究成為了研究的熱點?？衫每寡趸瘎⑸L因子、維甲酸、共培養(yǎng)等將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞[4-6]。本文探索了利用視網(wǎng)膜光感受器培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)BMSCs分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司； DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司) ，Neurobasal培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），B27(美國Invitrogen公司) ，胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美國sigma公司），多聚賴酸（美國sigma公司），小鼠抗大鼠單CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相應(yīng)同型對照單抗小鼠IgG1-FITC, IgG1-PE和IgG2a –PE（Beckman-Coulter公司），神經(jīng)元特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠醇化酶（美國 Fisher Scientific公司），光感受器特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)（RET-P1，美國Millipore公司），星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)（美國 Fisher Scientific公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），總抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國），OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本），OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式細(xì)胞儀（美國），臺式高速冷凍離心機（上海），Gene Amp 9700型PCR 擴增儀（美國），Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel DOC2000）（美國），AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）。

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

取清潔級SD大鼠，4mL／kg水合氯醛 (100g/L)進(jìn)行腹腔麻醉。碘伏消毒，無菌條件下取出大鼠的雙側(cè)脛骨和股骨，分別剪斷股骨干和脛骨中間及兩端的干骺剪斷，用含有肝素的培養(yǎng)液10mL進(jìn)行反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)過濾組織塊以及已凝血塊后，進(jìn)行離心后用20%FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，24h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每2d換液一次，換液前PBS洗去部分未貼壁細(xì)胞，當(dāng)70％～80％細(xì)胞達(dá)到融合時用0.25%胰蛋自酶消化傳代，進(jìn)行擴增培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達(dá)[7]。

1.2.2視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

在暗環(huán)境下無菌取下清潔級SD大鼠的眼球，游離出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。利用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化分離出光感受器細(xì)胞，用Neurobasal培養(yǎng)基A 1mL（加入1:50的B27和0.5mM L-glutamine）進(jìn)行避光培養(yǎng)，兩天換液一次，將視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞培養(yǎng)換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，通過0.22um過濾篩過濾后按2:3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后備用。分別把消化前和消化后的視網(wǎng)膜片進(jìn)行HE染色,在顯微鏡下觀察，同時對分離的光感受器細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.2.3對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)以及鑒定

將3代的rMSCs接種在6孔板中。分為2個對照組，4個實驗組。實驗組加入光感受器細(xì)胞上清液與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進(jìn)行誘導(dǎo)，對照組用Neurobasal培養(yǎng)基A與10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（2:3）進(jìn)行培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長及分化情況，誘導(dǎo)后14天，行免疫細(xì)胞化學(xué)和Rt-PCR鑒定，免疫細(xì)胞化學(xué)：PBS洗滌3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，過氧化酶阻斷，非免疫動物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200) ,GFAP(1:100)抗體，4℃過夜，加入生物素標(biāo)記的第二抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。RT—PCR法檢測實驗組和對照當(dāng)中的GFAP，NSE， Rhodopsin的表達(dá)。Rhodopsin引物上游引物ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCAGCCGATG 3’，擴增長度為107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGCGGTGTAAC 3’，擴增長度為156bp；GFAP引物上游引物：5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACCAGGAATAGACCTTCACAA 3’，擴增長度為482bp；內(nèi)參Rat GAPDH 為5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110為5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴增長度為595bp。參照TRIZOL試劑說明書對誘導(dǎo)的MSC分別提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，將 PCR產(chǎn)物電泳后進(jìn)行圖像分析儀采集圖像。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包(statistical package for the social science)分析，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)的大鼠的BMSCs接種后24小時開始貼壁，前3天細(xì)胞增殖慢，數(shù)量比較少，第3開始細(xì)胞的增長速度明顯增加，7天后就達(dá)到融合狀態(tài)，呈現(xiàn)漩渦狀、菊花狀。第三代時，細(xì)胞仍呈梭形，生長旺盛。BMSCs標(biāo)志鑒定結(jié)果表明，培養(yǎng)的第三代BMSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）（見圖1）。

圖1 大鼠MSC流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)

2.2 視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的鑒定

取下來的視網(wǎng)膜在消化前后分別進(jìn)行HE染色，消化前可以很清楚地觀察到九層細(xì)胞，說明取下來的是完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，不含有色素上皮，消化后的視網(wǎng)膜片，光感受器層的細(xì)胞變少，其它層細(xì)胞完整，光感受器細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)示，光感受器細(xì)胞的特異標(biāo)志物視紫紅質(zhì)的表達(dá)率達(dá)95%以上。

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)

實驗組BMSCs誘導(dǎo)后的第4天細(xì)胞形態(tài)開始變化，可見小的突起。隨后細(xì)胞便圓，突起增長，出現(xiàn)少量神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)，到14天最為明顯，出現(xiàn)一、二級分支，相互之間連接呈網(wǎng)狀。對照組也有少量的細(xì)胞呈神經(jīng)樣的形態(tài)。誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細(xì)胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈強陽性。非神經(jīng)元樣細(xì)胞呈多邊形或梭形，上述抗體染色呈弱陽性。陰性對照未見染色。

免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，共培養(yǎng)2周后，陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示： rMSC的Rhodopsin表達(dá)率實驗組為35.1%±6.2 %（圖2A）,而對照組中無Rhodopsin陽性的細(xì)胞（圖2B）， rMSC的NSE表達(dá)率實驗組為33.6%±4.0 %（圖3A），對照組為10.6%±5.0%（圖3B）, rMSC的GFAP實驗組的表達(dá)率為9.6%±1.5 %（圖4A），對照組為：13.7%±3.0 %（圖4B）；對照組與實驗組進(jìn)行兩樣本的t檢驗NSE：F =0.09，方差齊，P < 0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義，GFAP：F =1.726，方差齊，P ＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

A:實驗組大量表達(dá)Rhodopsin(×100)；B:對照組未表達(dá)Rhodopsin(×100)

A:實驗組大量表達(dá)NSE(×100)；B:對照組少量表達(dá)NSE(×100)

A:實驗組表達(dá)有GFAP(×100)；B：對照組表達(dá)有GFAP(×100)

RT-PCR鑒定結(jié)果分析顯示，實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達(dá)，其中GFAP表達(dá)比較弱；而對照組的只表達(dá)GFAP和NSE，且均較弱，未見Rhodopsin條帶(圖5)。

A:為實驗組，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達(dá)；B:為對照組，只表達(dá)GFAP和NSE。

3 討論

本實驗?zāi)M視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為視網(wǎng)膜細(xì)胞，利視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞培養(yǎng)上清液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行向視網(wǎng)膜樣細(xì)胞誘導(dǎo)。本實驗關(guān)于視紫紅質(zhì)的檢測，實驗組表達(dá)率高達(dá)35.1 %±6.2 %，對照組沒有表達(dá)，說明其光感受器條件培養(yǎng)基能使MSC向光感受器細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。從而驗證了大鼠MSC確實可以在體外被誘導(dǎo)為表達(dá)視紫紅質(zhì)的光感受器樣細(xì)胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或與視網(wǎng)膜片共培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)Rhodopsin的證據(jù)。Anthony等[5]對BMSCs向視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞誘導(dǎo)分化進(jìn)行了體內(nèi)外實驗。利用維甲酸、?；撬岷虴GF體外將小鼠 BMSCs成功誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞可以表達(dá)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)志物：視紫紅質(zhì)、視蛋白和恢復(fù)蛋白，最近國內(nèi)學(xué)者單純用EGF也可以誘導(dǎo)rMSC表達(dá)Rhodopsin[9]。本實驗當(dāng)中NSE表達(dá)率也明顯高于對照組，而GFAP，兩組表達(dá)并無差異，說明，光感受器條件培養(yǎng)基促進(jìn)rMSC向神經(jīng)元細(xì)胞方向分化，而對于膠質(zhì)細(xì)胞方向分化并無誘導(dǎo)作用。本實驗的對照并未加誘劑的rMSC也能表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志，Tomita M[8]研究說明沒有生長因子誘導(dǎo)的MSC沒有向神經(jīng)方向分的證據(jù)，強調(diào)生長因子在神經(jīng)分化中的重要地位，但是也有許多學(xué)者提出了在未誘的條件下仍發(fā)現(xiàn)神經(jīng)特異性標(biāo)志物的表達(dá)，Tondreau T等[10]發(fā)現(xiàn)未誘的的MSC也可以表達(dá)神經(jīng)特異標(biāo)記物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羥化酶等。Deng J[11]研究中也證實，體外培養(yǎng)大鼠的MSC具有自發(fā)表達(dá)早期的神經(jīng)標(biāo)記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物，如神經(jīng)微絲M（FNM），這些跟本實驗對照組仍能誘導(dǎo)的MSC能表達(dá)NSE相一致。

我們的實驗利用光感受器細(xì)胞上清液模擬視網(wǎng)膜體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液可能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與分化方面起重要作用。盡管BMSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但是還面對了許多待進(jìn)一步解決的問題：（1）對于BMSC的鑒定一直都沒有一個統(tǒng)一的說法，對BMSC的細(xì)胞學(xué)特點和分化各階段細(xì)胞標(biāo)志物的進(jìn)一步研究；（2）光感受器細(xì)胞在體外的外節(jié)容易脫落變性，如何進(jìn)一步保持其完整性以及存活時間；（3）體外BMSC向視網(wǎng)膜樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化模式和分子調(diào)控機制還不甚清楚，其誘導(dǎo)的微環(huán)境還比較復(fù)雜，有的學(xué)者直接采用雞尾酒式的加入好幾種生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)，對于其中各生長因子具體作用以及相互間的作用仍不清楚；（4）對于本實驗誘導(dǎo)出來表達(dá)視紫紅質(zhì)的MSC細(xì)胞的與真正的光感受器細(xì)胞之間不管是從形態(tài)上還是都有很大的差距，縮短這一差別，將MSC真正應(yīng)用于眼科臨床，還需進(jìn)一步深入的研究探索。

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中國衛(wèi)生部聯(lián)合攻關(guān)課題基金(No．WKJ2005-2－013)；人事部留學(xué)回國人員優(yōu)秀課題基金(No．GR-2006-FJ-1)

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。