汪輝,彭新凱，曹小彥，胡朝暉，何紅梅

（長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410013）

HPLC測(cè)定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度評(píng)定

汪輝,彭新凱，曹小彥，胡朝暉，何紅梅

（長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410013）

建立高效液相色譜法測(cè)定測(cè)定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度評(píng)定方法,采用GB/T22388-2008高效液相色譜法測(cè)定測(cè)定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)。建立數(shù)學(xué)模型，根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF1059—1999)中有關(guān)規(guī)定評(píng)估其不確定度。結(jié)果表明，按數(shù)學(xué)模型計(jì)算奶粉中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70 mg/kg，擴(kuò)展不確定度為0.064 mg/kg，結(jié)果表達(dá)為(2.70±0.064)mg/kg。該方法建立的數(shù)學(xué)模型合理、可靠。

高效液相色譜；原料乳；乳制品；三聚氰胺；不確定度

0 引 言

三聚氰胺 (melamine)又稱三氨三嗪，簡(jiǎn)稱三胺,為白色或無(wú)色結(jié)晶是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料[1]。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，普通的全氮測(cè)定法測(cè)蛋白質(zhì)含量時(shí)不能排除這類偽蛋白氮的干擾，因而一些廠商為了能低成本而添加這種化工原料，以提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量。

測(cè)量不確定度對(duì)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)、測(cè)量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)以及檢測(cè)工作國(guó)際化等方面，都有重要的意義。目前，我國(guó)檢測(cè)三聚氰胺的方法已比較成熟，相關(guān)文獻(xiàn)也較多[2-5]，且已有農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)Y/T137222007、 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) GB/T22388-2008，GB/T22400-2008。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范的要求，結(jié)合日常的檢測(cè)工作，進(jìn)行HPLC測(cè)定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)（GB/T22388-2008）的測(cè)量不確定度評(píng)估[6]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

Waters1525高液相色譜儀配2996二極管陣列檢測(cè)器，717Plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Epower工作站，三聚氰胺（99.9%）。

1.2 色譜條件

色譜柱為WelchMaterialsAQ-C18色譜柱（250mm×4.6 mm,5 μm i.d.），柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉 （濃度為0.01 mol/L），檸檬酸（0.01 mol/L）-乙腈 （90+10， 體積比）， 檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 方法（參照GB/T22388-2008）

（1）提取。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL的具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超聲提取10 min,再振蕩提取10 min后，以不低于4 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。

（2）凈化。將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3 mL水、3 mL甲醇洗滌,抽至近干后，用6 mL氨化甲醇液溶液洗脫。洗脫液于50℃下氮?dú)獯抵两?準(zhǔn)確加入1 mL流動(dòng)相,在快速混勻器上混勻1 min，經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的質(zhì)量濃度，mg/L；m為樣品的質(zhì)量，g；V為樣品稀釋體積，mL；frec回收率校正因子，等于回收率的倒數(shù)。

2.2 不確定度的主要分量[7-10]

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的濃度引入的不確定度urel(c)：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程玻璃儀器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程溫度變化產(chǎn)生的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度。

（2）樣品稱量引入的不確定度urel(m)：由天平的最大允許誤差引起。

（3）體積引入的不確定度urel(V)：由定容體積和進(jìn)樣體積的不確定度組成。

（4）樣品處理過(guò)程引入的不確定度urel(frel)：測(cè)試樣品的制備過(guò)程非常復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)均質(zhì)、溶液轉(zhuǎn)移、過(guò)濾、固相萃取等步驟，每一步操作都會(huì)引入不確定度，要逐步確定每一步驟對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)是相當(dāng)困難的，可采用檢測(cè)方法確認(rèn)中的有關(guān)數(shù)據(jù)，如回收率對(duì)制樣過(guò)程引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

2.3 不確定度urel(c)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，三聚氰胺的不確定度為0.5%，按正態(tài)分布考慮，包含因子K=3，屬B類評(píng)定，故其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 配制過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制過(guò)程：精確稱取0.1000 g三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加甲醇水溶液溶解并定容至100 mL，質(zhì)量濃度為1.0 g/L。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度。

查稱量使用的Sartorius CP225D電子天平檢定證書，其最大允許誤差0.05 mg，重復(fù)性誤差0.02 mg，該天平屬于一級(jí)天平，一般采用矩形分布，包含因子為，屬B類評(píng)定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）玻璃量具引入的不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中使用了一系列玻璃量具，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG196-2006》的要求，均有相應(yīng)的最大允差。歐洲分析化學(xué)中心(EURACHEM)認(rèn)為其服從三角分布，故K=，由此估算不確定度分量。表1為玻璃量具校準(zhǔn)的不確定度。

表1 玻璃量具校準(zhǔn)的不確定度

由表1中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)不確定度為

（3）溫度變化產(chǎn)生的不確定度評(píng)定。

溫度波動(dòng)產(chǎn)生不確定度：T校正=20℃，而實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±3）℃變動(dòng)，該影響引起的不確定度可通過(guò)估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)進(jìn)行計(jì)算，溶劑以水為代表，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，玻璃的膨脹系數(shù)為9.75×10-6℃-1(可忽略不計(jì))。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)溫度變化是矩形分布。

表2 溫度變化的不確定度

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度評(píng)定urel(x曲)

配制質(zhì)量濃度為0.5，0.8，1，2，5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)量6次。

由表2中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)不確定度為

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=4.67×105x+3.27×103，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

以某品牌奶粉樣品為例，6次測(cè)定后，由線性方程得到c＝1.18 mg/L，則由擬合曲線求x時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：SR為從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的Y與相應(yīng)測(cè)得值Yi之差按貝塞爾公式求出的標(biāo)準(zhǔn)偏差；m為樣品溶液的測(cè)定總次數(shù)，m=6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定總次數(shù)，n=6；c為樣品中三聚氰胺質(zhì)量濃度的平均值；c0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺質(zhì)量濃度的平均值；c為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度。

2.4 樣品稱量的不確定度評(píng)定

用Mettler AL204天平 (檢定證書給出最大允許誤差0.5 mg，重復(fù)性誤差0.3 mg)準(zhǔn)確稱取樣品2 g，由稱量產(chǎn)生的不確定度按矩形分布考慮，包含因子k=

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、玻璃量具校準(zhǔn)和溫度變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為屬B類評(píng)定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 樣品定容的不確定度評(píng)定

2.5.1 體積的不確定度評(píng)定

（1）樣品定容過(guò)程中使用了一系列玻璃量具。1 mL單標(biāo)線吸量管、5 mL單標(biāo)線吸量管、25 mL容量瓶的最允許誤差分別為±0.007，0.015，±0.03 mL。評(píng)定方法同2.3.2（2），可得定容體積V1mL單標(biāo)線吸量管、V5mL單標(biāo)線吸量管、V25mL容量瓶的相對(duì)不確定度u17、u18、u19分別為2.85×10-3、1.22×10-3、4.90×10-4。 則合成的相對(duì)不確定度為

（2）樣品定容過(guò)程中溫度變化產(chǎn)生的不確定度評(píng)定方法同3.1.2.3。 可得V1mL單標(biāo)線吸量管、V5mL單標(biāo)線吸量管、V25mL容量瓶的相對(duì)不確定度u20、u21、u22分別為3.64×10-4、3.64×10-4、3.64×10-4。則合成的相對(duì)不確定度為

（3）由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用waters 717plus高精度自動(dòng)進(jìn)樣器，由進(jìn)樣體積引入的不確定度可忽略不計(jì)。則樣品定容中的總體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為

2.6 樣品處理過(guò)程產(chǎn)生的不確定度評(píng)定（屬A類不確定度）

制樣過(guò)程產(chǎn)生的不確定度采用添加2.5 mg/kg(與所測(cè)定樣品濃度水平相近)6次樣品回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。6次回收率測(cè)定結(jié)果為90.9%，92.4%，91.1%，92.5%，89.6%，92.6%，平均回收率為=91.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為=1.20%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

同時(shí)，必須對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以確定回收率校正因子frec是否在計(jì)算公式中采用。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)（見表4）。

表4 t-檢驗(yàn)規(guī)則

式中，t＞2.58，說(shuō)明frec與100%有非常顯著差異，必須在計(jì)算公式中采用frec修正結(jié)果。

2.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因?yàn)楦鶕?jù)文中給出的數(shù)學(xué)模型，各分量無(wú)相關(guān)性。因此，將以上各相對(duì)不確定度分量合成為

2.8 擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按國(guó)際慣例，取包含因子k=2，被測(cè)量之值的大約95%可望含于此區(qū)間，則擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.9 測(cè)量不確定度報(bào)告

按照GB/T22388-2008實(shí)驗(yàn)室方法 《原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法》測(cè)定奶粉中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果為

3 結(jié) 論

綜上所述，最終結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度和試樣處理過(guò)程產(chǎn)生的不確定度所引起，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的測(cè)定所引起的不確定度以及量具所引起的不確定度，由樣品稱量的不確定度極小，可忽略不計(jì)。

在實(shí)驗(yàn)中，在樣品處理過(guò)程中更加規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作來(lái)增大回收率、同時(shí)增加測(cè)定次數(shù)和選用更高精度的量具，則可以將結(jié)果的不確定度進(jìn)一步減小。

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Uncertainty evaluation of high performance liquid chromatographic determination of melamine in raw milk and dairy products

WANG Hui，PENG Xin-kai，CAO Xiao-yan，HU Zhao-hui，HE Hong-mei
(Changsha Center of Supervision and Inspection on Food Quality Safety,Changsha 410013,China)

Objective:A assess method of measuring uncertainty was established according to GB/T22388-2008 which determined melamine in raw milk and dairy products by HPLC.Methods:A mathematical model was established which evaluated uncertainty according to“Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”.Results:The content of milk powder was 2.70 mg/kg according to mathematical model established in the study，expanded uncertainty was 0.064 mg/kg ，an d the expression

of uncertainty was(2.70±0.064)mg/kg.Conclusion:The mathematical model was established was logical and credible.

HPLC；raw milk；dairy products；melamine；uncertainty

TS252.7

A

1001-2230（2010）03-0058-04

2009-11-11

汪輝（1983-），男，助理工程師，主要要從事食品質(zhì)量安全分析與研究。

曹小彥