馮大偉，周家春，黃龍

(1.華東理工大學 食品科學與工程系，上海 200237；2.帝斯曼(中國)有限公司 食品創(chuàng)新中心，上海 210203)

發(fā)酵劑的篩選及其對攪拌型酸奶理化特性的影響

馮大偉1，周家春1，黃龍2

(1.華東理工大學 食品科學與工程系，上海 200237；2.帝斯曼(中國)有限公司 食品創(chuàng)新中心，上海 210203)

通過調查單菌株發(fā)酵特性、球菌/桿菌比例的選擇、菌株復配后的性能，得到了4組優(yōu)化的發(fā)酵劑配方。在不添加任何增稠劑的條件下，其發(fā)酵的酸奶在28 d貨架期內質構、后酸化程度表現(xiàn)優(yōu)異且穩(wěn)定。此外，為了預測酸奶貨架期后酸化程度的強弱，比較了15組28 d儲存期實驗與加速實驗中所得的pH值及其變化趨勢。結果表明，加速試驗中趨于定值時的pH值可以作為判斷后酸化程度強弱的先行指標。

發(fā)酵劑；酸奶；貨架期；后酸化；質構

0 引 言

酸奶因其風味獨特、營養(yǎng)價值高以及有益人體健康，倍受青睞。據(jù)報道，地中海周邊地區(qū)成為世界三大疾病(心腦血管疾病、癌癥、老年癡呆癥)發(fā)病率最低的地區(qū)與居民喜食酸奶有關[1]。

發(fā)酵劑是指為制作發(fā)酵乳制品而調制的含乳酸菌的培養(yǎng)物[2]。目前國內大型乳品企業(yè)幾乎全部使用直投式發(fā)酵劑(Directed Vat Set)發(fā)酵牛乳[3]。DSM公司是直投式發(fā)酵劑的主要生產(chǎn)商之一。

攪拌型酸奶在貯存過程中會出現(xiàn)乳清析出、風味不良、口感差和后酸化嚴重等問題[4]。酸奶發(fā)生后酸化(post acidification)，出現(xiàn)消費者不可接受的酸味，縮短了酸奶的貨架期[5]。發(fā)酵劑的菌株特性與酸奶的理化特性有著密切關系。本研究主要針對后酸化及質構兩大問題，使用DSM菌種，以期篩選出貨架期內品質優(yōu)良的酸奶用復合型發(fā)酵劑菌種。

1 材料與方法

1.1 主要材料

若懸河Y若懸河Y菌株：保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）3株，分別記作LB1，LB2，LB3；嗜熱鏈球菌 （Streptococcus thermophilus,ST）6株， 分別記作ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；復合型酸奶發(fā)酵劑STA（由不同確定的嗜熱鏈球菌菌株混合而成）均由DSM食品配料部提供。接種量均為5 U/1000 L牛奶，其中U為DSM菌種含量使用單位。

原料為全脂奶粉（進口），白砂糖（食品級）；培養(yǎng)基為MRS瓊脂（MERCK），M17瓊脂（OXOID）；檢測試劑為乙醛檢測試劑盒。

1.2 主要設備

均質機，恒溫水浴槽（高、中、低溫）3臺，pH計，發(fā)酵監(jiān)控儀，黏度計，自動漩渦振蕩混合器，高壓滅菌器，生物安全柜，電子天平，恒溫培養(yǎng)箱，厭氧罐，分光光度計。

1.3 酸奶的制作工藝

純凈水→預熱至50～60℃→加質量分數(shù)為12%全脂奶粉，780 r/min攪拌15 min→質量分數(shù)為6%白砂糖混合15 min→升溫至65℃均質 (20 MPa)→殺菌(95℃，5 min)→ 冷卻至42～43℃接入發(fā)酵劑恒溫發(fā)酵→pH值4.5以下結束發(fā)酵，恒溫水浴冷卻至20℃→100 r/min框式攪拌槳攪拌15 min→灌裝至酸奶杯，4℃恒溫冰箱冷藏及后熟→隔天檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 pH值

pH計用于酸奶發(fā)酵終點及儲存期間pH值變化的檢測。CINAC用于發(fā)酵期間pH值的全程監(jiān)控。為了考察酸奶貨架期后酸化程度，進行如下加速試驗：pH值達到4.5后，樣品結束發(fā)酵，而CINAC繼續(xù)在43℃恒溫水浴下，監(jiān)控酸奶后續(xù)pH值變化直至pH值穩(wěn)定（1 d左右）。記錄發(fā)酵特征參數(shù)，分析發(fā)酵過程變化特征。

1.4.2 滴定酸度

按照GB/T 5009.46-2003提供的方法進行測定。具體方法：準確吸取10 mL試樣于150 mL錐形瓶中，加20 mL經(jīng)煮沸冷卻后的水及數(shù)滴酚酞指示液，混勻，用氫氧化鈉標準溶液 (本研究實際使用濃度為0.1016 mol/L)滴定至初現(xiàn)粉紅色，并在0.5 min內不褪色，消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液毫升數(shù)乘以10即為酸度(°T)。

1.4.3 黏度

將酸奶樣品從4℃冰箱取出，Brookfield DVII+Pro黏度計檢測。檢測條件為：S63轉子，轉子轉速10 r/min，30 s后讀數(shù)。

1.4.4 乙醛質量分數(shù)

在乙醛脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的作用下，乙醛定量氧化成乙酸，NAD被還原為NADH。通過紫外分光光度計在波長340 nm下測得的NADH生成量可求得乙醛質量分數(shù)。詳細操作請見產(chǎn)品說明書(Acetaldehyde UV-method,Cat.No.0668613)。

1.4.5 活菌數(shù)

分別在發(fā)酵結束后1，7，14，21，28 d時取1.00 g酸奶樣品，用無菌生理鹽水逐級稀釋至合適的倍數(shù)后，采用平板傾注法接種并倒置培養(yǎng)。

嗜熱鏈球菌的選擇性計數(shù)：M17瓊脂培養(yǎng)基，有氧環(huán)境，37 ℃，24 h。

保加利亞乳桿菌的選擇性計數(shù)：MRS瓊脂培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境，37 ℃，72 h。

1.4.6 感官評價

酸奶4℃冷藏1 d后進行感官評價。主要對酸奶的組織狀態(tài)、滋味和氣味進行評價。質構指標包括拉絲性、光滑度、黏聚性和稀稠度；滋味指標包括甜味、酸味、苦味、奶油味；氣味指標包括奶油味、乙醛味。

酸奶的拉絲性指當用小勺舀起酸奶時，酸奶能夠被拉斷時的距離。特別是在酸奶采用產(chǎn)黏菌種時，可以比較不同菌種產(chǎn)生的效果；酸奶的粘聚性反映的是酸奶內部的聚結程度，在口腔表現(xiàn)為酸奶在舌頭上擴散的速度；稀稠度反映的是酸奶流動的難易程度。

感官評價得分采用10分制，其中1代表該指標特征強度最弱，10代表特征強度最強。

2 結果與討論

2.1 酸奶發(fā)酵劑的單菌株發(fā)酵特性

2.1.1 保加利亞乳桿菌的發(fā)酵特性

優(yōu)良的酸奶發(fā)酵劑菌株必須具有較好的發(fā)酵特性。各單菌株的發(fā)酵特性往往決定了復配后的發(fā)酵表現(xiàn)。圖1為保加利亞乳桿菌發(fā)酵特性曲線。

由圖1可以看出，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸奶pH值達到4.5以下所需時間基本在10 h左右。42～43℃發(fā)酵58 h后pH值基本達到穩(wěn)定。LB3產(chǎn)酸速度最快，只需8.42 h就能使牛乳pH值達到4.5，但穩(wěn)定時的pH值也比較低，pH值為3.47。LB1和LB2在發(fā)酵初期經(jīng)歷了不同程度的延滯期，因此相對于LB3，體系pH值達到4.5所用時間較長，同為12.58 h。23 h后，兩條重合的發(fā)酵曲線分開，LB1產(chǎn)酸速度變快，最終pH值與LB3相同。LB2發(fā)酵的酸奶貨架期后酸化加速試驗的最終pH值為3.53，后酸化程度最弱。對發(fā)酵至pH值為4.5的酸奶隔天進行感官評價，使用LB2發(fā)酵的酸奶，奶香濃郁；而使用LB3發(fā)酵的酸奶，乙醛香味濃郁。

2.1.2 嗜熱鏈球菌的發(fā)酵特性

由圖2可以看出，ST2和ST3的發(fā)酵進程幾乎一致，僅在發(fā)酵中期（2.0～4.5 h）有所不同。發(fā)酵至pH值為4.5所需時間最短的為ST6，僅需4.33 h，但其pH值穩(wěn)定時的值也最低?？傮w來說，除了ST1，其余嗜熱鏈球菌的發(fā)酵速度都比保加利亞乳桿菌的快。嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸奶pH值穩(wěn)定時的值普遍較高，都在pH值為3.9以上，而3株桿菌在pH值為3.5左右。這表明酸奶后酸化的程度是由保加利亞乳桿菌決定的。ST5的發(fā)酵周期較長，但是穩(wěn)定時的pH值為4.17，后酸化程度較弱。ST1的發(fā)酵時間最長且發(fā)酵終點pH值為4.39，發(fā)酵初期出現(xiàn)pH值不降反升的現(xiàn)象，可能是由于該株菌代謝產(chǎn)物較為特殊，需經(jīng)進一步的研究。ST4發(fā)酵的酸奶，奶香味濃郁。ST1發(fā)酵過程過長，發(fā)酵期間易被雜菌污染，發(fā)酵結束時酸奶已腐敗變質。

2.2 酸奶發(fā)酵劑球桿菌比例與后酸化的關系

圖3為貨架期后酸化加速實驗中TpH4.5，Tmax，pHmax，pHend隨球菌用量變化結果。

表2 球菌桿菌復配后的發(fā)酵特性及酸奶黏度表現(xiàn)

由圖3可以看出，單獨由嗜熱鏈球菌發(fā)酵，達到最大酸化速度時的pH值為5.53；單獨由保加利亞乳桿菌發(fā)酵，達到最大酸化速度時的pH值為4.92。表明酸奶在發(fā)酵過程中，首先快速生長的是嗜熱鏈球菌，當pH值從6.5下降到5.5時，保加利亞乳桿菌的生長開始加快，而嗜熱鏈球菌的生長逐漸減慢，pH值下降到5.0左右時，保加利亞乳桿菌控制了酸奶的發(fā)酵[6]。隨著發(fā)酵劑中嗜熱鏈球菌比例的增加，發(fā)酵時間不斷縮短。完全由嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸奶，發(fā)酵時間只需260 min，表明酸奶發(fā)酵時間的長短并非由保加利亞乳桿菌起主導作用，這與趙征等[7]的研究結果相悖。

酸奶pH值不僅影響產(chǎn)品本身的口味，而且對產(chǎn)品的貨架期有較大的影響。在酸奶發(fā)酵劑中調整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例可使酸奶后酸化程度減弱[8]?？疾熵浖芷诤笏峄铀僭囼灲Y果(圖3)，隨著發(fā)酵劑中保加利亞乳桿菌所占比例的下降，pH值穩(wěn)定時的值越高，表明后酸化程度也越弱。郭清泉[9]研究表明，保加利亞乳桿菌是導致后酸化發(fā)生的主要發(fā)酵劑菌，其細胞壁或細胞膜的性質保護了桿菌的乳糖酶活性。酸奶在儲存期中，保加利亞乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵乳糖，最終使pH值下降到3.5。

實驗表明，當發(fā)酵劑中桿菌的比例較高時，發(fā)酵周期較長且酸奶的后酸化程度較嚴重，嚴重影響酸奶風味，貨架期大大縮短。球菌含量較高時，結果則相反。但是考慮到酸奶的特有風味物質乙醛基本上是由桿菌產(chǎn)生的，因此最終確定后續(xù)試驗的球菌桿菌用量比為0.8 U︰0.2 U。

2.3 酸奶發(fā)酵劑球菌桿菌復配配方的篩選

嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌以接種比例為0.8 U︰0.2 U，總接種量為5 U/1000 L牛奶接種發(fā)酵，所得結果如表2所示。

由表2可以看出，ST6與3株桿菌進行復配，發(fā)酵周期均為最短，只需255 min左右，故將其作為后續(xù)篩選實驗的候選菌株。與ST6相反，ST1與各桿菌復配，由于發(fā)酵周期普遍偏長，故不適宜作為發(fā)酵劑菌種。ST5與LB3具有較為明顯的弱后酸化現(xiàn)象，故也作為候選菌株。實驗發(fā)現(xiàn)，ST5和ST6與各桿菌復配發(fā)酵后的酸奶，酸奶黏度偏低，在感官評價上表現(xiàn)為粘聚性小、粉狀，質構有缺陷，因此試圖通過在原有配方中添加產(chǎn)黏菌株改善其質構。一些乳酸菌能夠產(chǎn)生胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)。胞外多糖是指菌株在其生長、代謝過程中分泌多糖于細胞外，形成莢膜多糖黏附于細胞表面，或以粘質多糖形式存在于細胞周邊培養(yǎng)基中，其形成有利于改善產(chǎn)品的黏度和質構，防止酸奶凝膠破裂和乳清析出[10]。ST2，ST4，LB2是產(chǎn)胞外多糖菌株，能改善酸奶質構，且ST2和ST4用作酸奶發(fā)酵劑，發(fā)酵周期較短，后酸化程度較弱，因此也作為候選菌株進行后續(xù)篩選。

綜上所述，選取6株單菌株再加上發(fā)酵劑STA以ST︰ST︰LB為0.4 U︰0.4 U︰0.2 U進行3株乳酸菌復配實驗。 其中，ST5與ST6（非產(chǎn)黏菌株）、ST2與ST4（產(chǎn)黏菌株）由于質構特性相近故不必相互組合與桿菌復配。結果顯示，實驗各組酸奶發(fā)酵周期在260～310 min之間， 儲存1 d后黏度在5.675～7.834 Pa·s之間，表明發(fā)酵時間適宜，黏度適中。貨架期后酸化加速試驗中pH值穩(wěn)定時的pH值在3.85～4.02之間，而4℃恒溫保存28 d后所測得的各組酸奶樣品pH值在4.20～4.36之間。前者與后者比較，前者的pH值均低于后者，但各組加速試驗和非加速試驗之間的相關性較強，因此加速實驗所得的結果作為判斷貨架期后酸化程度的指標是可行的。

對以上各組3株乳酸菌聯(lián)合發(fā)酵所得酸奶的感官進行評價，優(yōu)選出了4組，分別為：1#(ST4-ST5-LB3)，2#(ST4-ST5-LB2)，3#(ST4-ST6-LB2)，4#(STAST2-LB2)。篩選得到的4組酸奶與市場上最暢銷的2款酸奶進行比較，如圖4所示。由圖4可以看出，1#、2#、3#樣品更接近暢銷2酸奶，4#樣品在感官上更接近暢銷1酸奶。

2.4 復合型發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶在貨架期內理化特性

考察了經(jīng)過篩選得到的4組酸奶在貨架期內的各方面理化特性的變化。

2.4.1 酸奶的后酸化

酸奶后酸化現(xiàn)象導致的結果是酸奶無法長期貯存。通過之前改變嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的比例、篩選弱后酸化的菌株等措施來控制酸奶的后酸化程度是具有明顯的效果的。圖5為4組酸奶儲存期內pH值與滴定酸度的變化。

由圖5可以看出，儲存期內隨著酸奶pH值的降低，滴定酸度值逐漸增大。1#和2#在儲存期內，pH值變化緩慢，保存28 d后pH值仍能達到4.3以上，滴定酸度在100°T左右，表明這兩款酸奶后酸化程度非常弱，能夠充分保證酸奶在貨架期內口味保持穩(wěn)定。4#產(chǎn)品在儲存期內pH經(jīng)歷了兩次下降及上升過程，7d之后的pH值變化范圍在4.25～4.35之間，也能符合貨架期內的品質穩(wěn)定的要求。而pH變化最為顯著的3#樣品，儲存期內的pH值均在4.2以上，滴定酸度在110°T以下，同樣能滿足口味要求。

2.4.2 酸奶的質構

在酸奶的加工與儲藏過程中，如灌裝過程、后酸化等，都會影響到酸奶的品質及質地，而其中較嚴重的表現(xiàn)為：蛋白沉淀、乳清析出、分層等，嚴重影響產(chǎn)品的可接受性。增稠劑的添加可改善酸奶的質地、防止乳清分離，但一些歐洲國家（如法國、荷蘭）明令禁止普通酸奶中添加增稠劑。而通過提高乳的總固形物含量，可以改善質構，但同時又增加了成本。一些乳酸菌菌株能夠產(chǎn)生胞外多糖(EPS)，這有助于改善酸奶的組織狀態(tài)和黏稠度[11]。因此選擇產(chǎn)黏菌株作為酸奶發(fā)酵劑已成為改善酸奶質構的優(yōu)選方法。此次研究中，使用了ST2，ST4，LB2產(chǎn)胞外多糖菌株用于改善產(chǎn)品質構，儲存期內均未發(fā)現(xiàn)乳清分離、分層等現(xiàn)象且酸奶表面光滑均一。

黏度是攪拌型酸奶生產(chǎn)過程中重要的控制項目之一，也是評價酸奶質量的重要指標。由圖6可知，4款酸奶儲存期內的黏度呈總體上升趨勢。表明在儲存期內，產(chǎn)黏菌株產(chǎn)生胞外多糖使得酸奶體系黏度增加，質構在經(jīng)歷攪拌、灌裝后得到恢復且明顯改善。3#相對于其他3款酸奶，黏度變化較弱，這可能是由于其儲存后期pH值相對較低的緣故，還需作進一步的研究。

2.4.3 酸奶的風味

優(yōu)質的酸奶必須具有良好的滋氣味。乙醛為酸奶中的主要風味物質之一，測定其在發(fā)酵乳中的質量分數(shù)對評價產(chǎn)品風味意義重大。圖7為4組酸奶儲存期內乙醛質量分數(shù)的變化。

由圖7可以看出，各款酸奶在儲存期內乙醛質量分數(shù)的變化在8.03～16.2 μg/g之間，變化趨勢不一，但是質量分數(shù)均高于7 μg/g[12]。2#和4#酸奶在保存21 d時乙醛質量分數(shù)較高，而1#和3#乙醛質量分數(shù)達到了最低。除了4#酸奶，其余3款酸奶在14 d后的乙醛質量分數(shù)均減少，這與Guzel-Seydim等[13]研究14 d后的酸奶乙醛質量分數(shù)減少的結果一致。

2.4.4 活菌數(shù)測定

評價酸奶品質，尤其是評估其生理機能時的一個重要指標就是產(chǎn)品中活性菌種的數(shù)量。而通過對酸奶中不同乳酸菌菌種選擇性計數(shù)的研究可以更好地評估酸奶的品質與活菌數(shù)內在的聯(lián)系。儲藏期內，乳酸菌仍處于緩慢的生長代謝過程中，耐酸性較強的保加利亞乳桿菌會保持其發(fā)酵活性，使酸奶的酸度進一步升高。圖8為4組酸奶儲存期內嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌活菌數(shù)的變化。由圖8可以看出，儲存期內嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)呈下降趨勢，但都能保持在108mL-1以上，1#與2#和3#與4#的變化趨勢一致；保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)變化1#與其他3組有所不同，表現(xiàn)為上升趨勢，2#與4#表現(xiàn)相似。將活菌數(shù)變化結果與這4組配方中的菌株組成進行比較 （1#和2#用的球菌相同，2#、3#、4#用的桿菌相同），發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)的變化與各菌株的自身生長特性相關。圖9為4組酸奶儲存期內球菌桿菌比例與pH值之間的相互關系。

由圖9可以看出，儲存1 d后，球菌/桿菌比例已達到100︰1以上。后酸化程度與球菌桿菌的比例有關，后酸化程度極弱的1#、2#、4#，其儲存期后期球菌桿菌比例基本穩(wěn)定在3個數(shù)量級上；而后酸化程度較弱的3#，其球菌桿菌比例基本穩(wěn)定在2個數(shù)量級上。這進一步證明，改變球菌桿菌的比例能有效的控制后酸化程度，使酸奶的品質得到保證，具有更長的貨架期。

3 結 論

酸奶的感官及理化特性與發(fā)酵劑各菌株的特性有著密切關系。本文使用DSM菌種庫菌種，通過對酸奶發(fā)酵劑單菌株發(fā)酵特性的研究、球/桿菌比例的選擇、2株乳酸菌復配、3株乳酸菌復配后各性能 （酸度、質構、感官）的研究，篩選出了4組發(fā)酵劑配方。隨后，對其進行了28 d儲存期內各理化特性的考察。對后酸化、質構、風味、活菌數(shù)的評價表明，在不添加任何增稠劑的條件下，其發(fā)酵的酸奶質構及后酸化程度表現(xiàn)優(yōu)異且穩(wěn)定。

為了預測酸奶貨架期后酸化程度的強弱，采用了加速試驗。殺菌后的牛奶接入菌種后，發(fā)酵監(jiān)控儀在43℃恒溫水浴下持續(xù)監(jiān)控其pH值變化，直至pH值達到穩(wěn)定（1 d左右）。通過對各組穩(wěn)定時pH值大小的比較，可以篩選出后酸化程度較弱的菌種。對15組28 d儲存期實驗與加速實驗所得的pH值結果進行比較，表明該值作為判斷后酸化程度強弱的先行指標是可行且快速的。

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Effects of different starter culture blends on sensory,physico-chemical properties of stirred yoghurt

FENG Da-wei1,ZHOU Jia-chun1,HUANG Long2
(1.Department of Food Science and Technology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.DSM Food Innovation Centre,DSM(China)Ltd.,Shanghai 210203,China)

The fermentation performance both of single strain and strain blends with different ratios ofStreptococcus thermophilus to Lactobacillus bulgaricusin milk were investigated.4 optimum compositions of strain blends were selected accordingly.The low level of post-acidification and improved texture of stabilizer-free yoghurt were found during the shelf life of 28 d by using these 4 selected culture blends.The strains with low acidification level were selected by Accelerated Shelf Life Testing as well.The storage temperature of yoghurt was set to be 43℃as same as the fermentation temperature and the pH of sample was observed till the pH approached a constant value.This method was proved to be more effective and efficient for forecasting the post-acidification level during shelf life compared with conventional evaluation test.

Starter culture;Yoghurt;Shelf life;Post-acidification;Texture

TS252.54

A

1001-2230（2010）03-0022-05

2009-12-10

馮大偉(1984-)，男，碩士研究生，主要研究方向為乳品科學。

黃龍