李淑娟

摘要:固定化金屬螯合親和層析是一種有效的生物分子分離純化技術,它具有配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用強等特點。因此,其在蛋白質純化、復性和空間定位以及酶的固定化和金屬離子清除等方面具有廣泛的應用。

關鍵詞:固定化金屬螯合親和層析;純化;應用

固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一種親和純化技術,它是由 Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分離純化出數百種生物大分子。該法是基于蛋白質表面的一些氨基酸殘基與固定化金屬離子的親和力不同而對蛋白質進行分離純化。它因配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用強等特點而被廣泛應用。隨著研究的進一步深入,IMAC的新應用也不斷地被發(fā)現。

1金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對蛋白質進行分離。過渡態(tài)金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結合,金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點,在溶液中被水分子或陰離子占據。當蛋白質表面氨基酸殘基與金屬離子的結合力較強時,氨基酸殘基的供電原子將取代與金屬離子結合的水分子或陰離子,與金屬離子形成復合物,從而使蛋白質分子結合在固相介質表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸側鏈基團含有孤對電子的活性原子都能參與螯合反應,由于蛋白質表面這些氨基酸的種類、數量、位置和空間構象不同,因而與金屬配基的親和力大小不同,從而可選擇性地加以分離純化[2]。

2金屬螯合親和層析技術的應用

2.1金屬螯合親和層析用于生物分離純化

IMAC在生物分子純化方面具有很多優(yōu)點:(1)結合力強,蛋白結合容量大,可用于工業(yè)生產,如采用IMAC吸附介質的擴張床吸附(EBA)技術可從哺乳動物細胞培養(yǎng)粗提物中一步分離純化溶解性目標蛋白;(2)洗脫條件溫和,再生后配體恢復完全,一種IMAC樹脂可再生幾百次而不改變其層析特性;(3)價格便宜;(4)可通過改裝各種金屬離子,引入目標蛋白質最適宜的金屬離子進行不同蛋白質的純化。鑒于上述特點,IMAC不僅適用于某些蛋白質、酶、氨基酸及肽的分離純化,也適用于可逆螯合金屬離子的核苷酸、激素、抗體等物質的分離和純化。

目前,基因工程重組蛋白純化技術已經成熟,常通過DNA重組技術對蛋白進行標記,該方法在重組蛋白質表達過程中巧妙地將標簽(常為6×His尾巴)直接連接到蛋白質的N-末端或C-末端,這種基因工程蛋白與裂解液中的其他蛋白質相比,對金屬離子有更高的特異性,在分離純化后再用化學法或酶法將尾巴切掉。這種方法目前已經成為基因工程下游技術中對融合蛋白純化最常用的方法。國外公司已推出商品化試劑盒,美國Qiagen公司提供的QIAexpress系統就是較為經典的一種。該系統利用的pQE系列載體不僅有6個His編碼序列還含有強啟動子和多克隆位點等組成,可將目的基因在宿主細胞中高效表達。表達后的產物可直接用金屬螯合親和層析進行分離,有時可實現一步純化。金屬螯合親和層析過程既可以在常規(guī)的非變性條件下進行純化,還可以用于變性條件下(6mol/L鹽酸胍或8 mol/L尿素)純化,這對以包涵體形式存在的重組蛋白尤為有利。

2.2金屬螯合親和層析用于蛋白質的復性

在基因工程技術中,表達的重組蛋白多以包涵體形式存在,蛋白質經常會錯誤折疊而損失活性,這一難題長久以來都沒有得到很好的解決。高濃度的變性劑可以溶解包涵體,然后控制變性劑除去的速度,有時需要添加適當的氧化/還原試劑,蛋白質可以逐步折疊復性。通常使用的復性方法有三種,分別是稀釋復性,透析復性和層析復性。其中稀釋復性和透析復性過程中會有大量無活性蛋白質聚集體形成,而金屬螯合親和層析復性中,蛋白質能可逆吸附在固相介質上,可避免伸展的多肽分子之間形成聚集體。在高濃度變性劑存在的情況下,組氨酸尾仍舊具有吸附在金屬螯合親和層析介質上的能力,所以可在IMAC介質上同時實現復性與純化[3]。蛋白質吸附在IMAC介質上后,先逐步降低變性劑的濃度,使蛋白質折疊,然后提高咪唑濃度把折疊后的蛋白質洗脫出來。對于TNF蛋白,使用IMAC 獲得了90%的復性收率[4]。

2.3金屬螯合親和層析用于蛋白質的分析

金屬螯合親和層析可用于蛋白質的分析鑒定。Jiang等通過金屬螯合親和層析結合金屬離子親和毛細管電泳技術(IMACE)對糖基化導致α-胰凝乳蛋白酶結構變化進行了研究,證明糖基化作用產生兩個截然不同的蛋白質,他們對金屬離子的親和性完全相反[5]。

IMAC還可用于磷酸化蛋白分析。蛋白質的磷酸化和去磷酸化是生命體代謝調控的重要機制,已發(fā)現IMAC能鑒定磷酸化的蛋白,尤其是Fe3-IMAC已被用來選擇性純化和濃縮磷酸化的蛋白和多肽[6]。

IMAC與重組技術相結合可以使帶六聚組氨酸的蛋白質固定在基質上,從而為研究蛋白質的相互作用開辟了新的途徑。Celia等[7]用Ni2+負載的金屬螯合脂質定向膜捕獲組氨酸標記的MHC分子,再通過表面等離子體共振技術(Surface pasmon resonance)考察它們對T細胞受體的結合。錨定蛋白質的NTA/組氨酸標記體系也可被用來通過原子力顯微鏡測量受體-配體在單分子水平上的結合力[8]。

2.4金屬螯合親和層析技術在其他領域的應用

過渡態(tài)金屬離子和蛋白質結合的特性也成功應用在蛋白質芯片領域。Zhu等[9]提到了將帶有6個組氨酸的蛋白質固定于鍍鎳的玻璃板上,得到了比常規(guī)醛處理表面更高質量的蛋白質芯片。在酵母蛋白質組學研究中,通過克隆5800個開放閱讀框,相應的蛋白質純化后固定于鍍鎳板上可以篩選能與磷脂相互作用的蛋白質。使用這種技術鑒定了許多新的可與磷脂相互作用的蛋白質。

在固定化酶研究方面,受IMAC的啟發(fā),蛋白質的某些結構域可以“位點特異”的固定在固相載體表面,比隨機位點固定增加了被固定蛋白質的穩(wěn)定性并較好的保持了其空間結構,比如固定化酶時可提高酶的半壽期,多次重復使用酶活力亦無明顯損失[10]。

綜上所述,金屬螯合親和層析是一種重要的生物大分子分離純化技術,IMAC的應用將不僅局限于蛋白質的分離純化,其原理還將在蛋白質芯片、生物分子間相互作用、蛋白質結構研究、蛋白質的電化學檢測等方面得到應用,從而帶動相關領域研究的不斷發(fā)展。

參考文獻:

[1]Porath J, Carlsson J, Olsson I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation [J]. Nature, 1975, 258(5536): 598-599.

[2]Vijayalakshmi M A. Pseudobiospecific ligand affinity chromatography [J]. Trends in Biotechnology, 1989, 7(3): 71-76.

[3]Hutchinson M H, Chase H A. Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using metal affinity chromatography. Journal of Chromatography A, 2006, 1128(1-2): 125-132.

[4]Xu J, Zhou Q, Ma Z, et al. Study on construction of His6-human TNFβ fusion expression plasmid and single-step purification of its product [J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2000, 7: 1-5.

[5]Jiang K Y, Pitiot O, Anissimova M, et al. Structure-function relationship in glycosylated-chymotrypsin as probed by IMAC and IMACE [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1433(1-2): 198-209.

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[7]Celia H, Wilson-Kubalek E, Milligan R A, et al. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96(10): 5634-5639.

[8]Schmitt L, Ludwig M, Gaub H E, et al. A metal-chelating microscopy tip as a new toolbox for Single -molecule experiments by Atomic Force Microscopy [J]. Biophysical Journal, 2000, 78(6): 3275-3285.

[9]Zhu H, Bilgin M, Bangham R, et al. Global analysis of protein activities using proteome chips [J]. Science, 2001, 293(5537): 2101-2105.

[10]Ordaz E, Garrido-Pertierra A, Gallego M, et al. Covalent and metal-chelate immobilization of a modified 2-haloacid dehalogenase for the enzymatic resolution of optically active chloropropionic acid [J]. Biotechnology Progress, 2000, 16(2): 287-291.